[发明专利]一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法

摘要

一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。本发明包括：DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建。本发明提供一种DNA-三聚氰胺抗体偶联物，经过免疫识别与DNA的荧光定量PCR扩增，通过扩增后的荧光信号对三聚氰胺进行检测。本发明方法能实现对三聚氰胺超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量三聚氰胺药物的检测提供了一种有效的方法。

主权项

一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，其特征在于包括：DNA‑三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建；具体步骤为：（1）DNA‑三聚氰胺抗体偶联物的制备2.5mg双异功能团偶联剂4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo‑SMCC溶解于200μL超纯水，取2μL Sulfo‑SMCC溶液用pH7.4含150mM NaCl的100mM PBS缓冲液稀释至200μL，然后取200μL 6mg/mL的三聚氰胺抗体与200μL Sulfo‑SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400μL，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM EDTA的100mM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400μL，取200μL上述溶解溶液用于下步反应；将200μL 4nmol 89bp的ssDNA加入到200μL的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400μL含5mM EDTA的100mM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA‑三聚氰胺抗体偶联物；所述89bp的ssDNA为：5’‑SH‑GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC‑3’；（2）三聚氰胺包被抗原包被PCR管首先将PCR管用50μL 0.8%的戊二醛溶液在37℃包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次5min；用50μL 8μg/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在37℃包被2h，用pH7.2、含0.05% Tween‑20、10mM PBS的PBST缓冲液洗涤，再用pH7.2、含0.4%明胶、10mM PBS封闭缓冲液于37℃封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗涤步骤均洗涤3次，每次3min；（3）三聚氰胺传感器的构建在步骤（2）包被好的PCR管中，加入25μL 0.001pg/g～10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25μL步骤（1）合成的DNA‑三聚氰胺抗体偶联物，在37℃反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净；将上游引物和下游引物加入到SsoFast EvaGreen预混液中，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50μL含上游引物和下游引物的预混液，最后用荧光定量PCR仪CFX‑96进行测定；扩增条件为：首先95℃预变性30s，然后95℃变性5s、57℃退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65℃升温至95℃，每0.5℃读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线；上游引物: 5’‑GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT‑3’，下游引物: 5’‑GCCGAAAAATCTGGAAGGTC‑3’。