[发明专利]菊苣转基因植株的扩繁方法

摘要

本发明公开了一种菊苣转基因植株的扩繁方法，包括以下步骤：A1、农杆菌介导的转zeolin基因的菊苣植株的检测； A2、 转基因植株叶片灭菌；A3、转基因菊苣芽的诱导与增殖；A4、转基因菊苣芽生根； A5、转基因菊苣再生植株的PCR检测；A6、转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽。本发明以转基因菊苣叶片为外植体进行扩繁，分化率达90%以上，每个幼叶外植体平均可分化出18.69个不定芽，不定芽易于生根，生根率到90%以上，在芽分化、芽繁殖和生根阶段，都通过不同浓度的潮霉素筛选，PCR检测再生植株阳性率高达85.54%，是常规遗传转化率的7-8倍，炼苗移栽后平均成活率达97%以上。

主权项

一种菊苣转基因植株的扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、农杆菌介导的转zeolin基因的菊苣植株的检测：采用CTAB法提取转基因菊苣基因组DNA，以含有外源目的基因zeolin的质粒DNA做阳性对照，未转化菊苣植株DNA及ddH2O做阴性对照，利用设计的引物进行PCR扩增和Southern杂交检测，选取阳性的菊苣转基因植株，再用改良SDS法提取RNA，进行RT‑PCR检测，选取都为阳性的转基因菊苣作为后续材料；A2、 转基因植株叶片灭菌：选取步骤A1检测为阳性的转基因菊苣叶片，先采用自来水冲洗，在超净工作台上用0.1%HgCl2浸泡叶片8‑10min，期间不停摇动，无菌水反复冲洗4‑5遍，无菌滤纸吸干多余水分；A3、转基因菊苣芽的诱导与增殖：用无菌刀片将灭菌后的菊苣叶片切成0.5×0.5cm，叶片近轴面向下，接种在含25mg/L潮霉素、2.0mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、0.01mg/L TDZ的芽诱导培养基上诱导分化出不定芽绿点，将小芽点接种到含有15mg/L潮霉素、2.0mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA的芽增殖培养基上形成大量丛生芽； 所述芽诱导培养基：MS基本培养基+25mg/LHyg+2.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L IBA+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8～6.0；芽增殖培养基：MS基本培养基+15mg/L Hyg+2.0mg/L  6‑BA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8～6.0；A4、转基因菊苣芽生根：待丛生芽长到2‑3cm时，小心将芽剥离叶片基部，接种到含有10mg/LHyg和0.1mg/L NAA的生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基：1/2MS培养基+10mg/LHyg+0.1mg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值5.8～6.0；A5、转基因菊苣再生植株的PCR检测：在无菌操作台上，从玻璃瓶中取出生根20天左右的转基因扩繁菊苣，剪取叶片1‑2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，进行PCR检测，将阳性的再生植株重新转入新的1/2MS培养基中继续培养至炼苗；A6、转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽：对步骤A5检测为阳性的再生植株进行炼苗和移栽，具体炼苗方法为：首先在培养室中将封口膜或瓶盖打开，适应1‑2天，在培养容器内注入清水，温室中炼苗2‑3d，然后取出小植株，小心洗净根部的培养基，移栽到装有灭菌基质的花盆中，于温室炼苗5d后移到室外常规培养，每2天喷施1/2MS盐溶液；植株炼苗后移栽到田间，成活的植株即为扩繁的带有外源目的基因的转基因植株。