[发明专利]滇池金线鲃鳍细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种滇池金线鲃鳍细胞系的构建方法，属于淡水水生生物细胞培养技术领域。该方法是以滇池金线鲃鳍条组织为材料，采用组织块法，在含有胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，pH值为7.2-7.4的L-15培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行继代培养；具体包括制备细胞培养液、鳍组织微创取样、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、采用微创处理，在保证鱼体存活的前提下，操作简便易行；2、构建的滇池金线鲃鳍细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对滇池金线鲃种质资源保存和理论研究及应用的需要；3、该构建方法也适用于其他鱼类构建鳍条的细胞系。

主权项

滇池金线鲃鳍细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的步骤如下：a.制备细胞培养液选择pH值为7.2‑7.4 的L‑15培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子终浓度为5 ng/ml，于4℃冰箱中保存，备用；b.鳍组织微创取样将活鱼置于含有8 mg/L高猛酸钾的溶液中消毒10 min，然后用无菌器械取尾鳍，置于12孔板中，加入HBSS+200 IU/ml 青霉素+200 μg/ml链霉素+15 μg/ml两性霉素B的溶液3 ml，消毒后鱼体放回鱼缸中饲养，经过3个月的日常护理鳍条重新长出；c.原代培养在无菌操作台中取出尾鳍组织，用HBSS+200 IU/ml 青霉素+200 μg/ml链霉素+15 μg/ml两性霉素B的溶液清洗三次，然后将组织剪成±1 mm3的小块，均匀接种于25 cm2培养瓶中，在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入L‑15+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml 青霉素+100 μg/ml链霉素+10 μg/ml两性霉素B的细胞培养液3 ml，在20℃培养箱中启动原代培养，每3天半量更换培养液，第7天细胞开始从组织块中迁移，50天长成细胞单层；d.传代培养待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，加入0.13%的胰蛋白酶溶液1 ml，消化2min，细胞变圆后，加入吸出的培养液1 ml，再加入L‑15+20%FBS+5 ng/ml bFGF的细胞培养液8 ml，均匀接种于两个培养瓶中，于20℃培养箱中培养；每7天传代一次，传至第5代时，细胞培养液中血清含量减为10%，此时，细胞系建立成功。