[发明专利]一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法

摘要

本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的糖链与蛋白分离，在8～12KD分子筛上糖蛋白的O-连接糖链经β-消除反应释放，通过清洗、反复离心的方法使O-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而一步实现了O-糖链的分离。该方法分离糖链效果明显，并避免了因非特异性吸附和化学反应带入副产物；反应效率高、反应步骤简明。

主权项

一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O‑连接糖链的方法，包括以下步骤：（1）蛋白样品的预处理取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O‑连接糖链分离将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；加入1M NaBH4/0.05M NaOH溶液（即NaBH4和NaOH的混合水溶液，其中NaBH4的终浓度为1M，NaOH的终浓度为0.05M）；再经过40～50℃水浴后，离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，即得到已分离的糖蛋白全O‑连接糖链；再用冰醋酸调节pH值至中性后，冷冻干燥备用。