[发明专利]筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法

摘要

本发明提供了一种筛选生产底物广泛性腈水解酶的菌株的方法。具体地说，本发明提供了一种利用三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，筛选生产底物广泛性腈水解酶的菌株的方法。由通过该方法筛选获得的菌株所生产的腈水解酶具有较好的底物广泛性，能够水解羟基腈、普通腈类及芳香腈类产生相应的羧酸。该方法筛选获得菌株所生产的腈水解酶具有很好的底物广泛性，并且存在着水解条件温和、环境友好等优点。

主权项

一种筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法，其特征在于采用三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，将适合微生物生长的样品经过活化、初级富集、再富集后经过Berthelot初筛、高压液相复筛步骤后获得生产底物广泛性的腈水解酶的菌株，其中所述活化、初级富集、再富集后经过Berthelot初筛、高压液相复筛步骤如下：(1)活化步骤，将经水洗后的固体样品的水洗液或者液体样品于25℃～37℃放置12～24小时；(2)初步富集步骤，在活化步骤后向样品中添加1％～2％的含三羟基丙腈的选择性筛选液体培养基；(3)再富集步骤，取1ml经初步富集的样品接种到选择性筛选液体培养基中，在37℃继续富集培养12～24小时后，取50～200μL富集培养液涂布于选择性筛选培养基固体平板，经36～72小时获得单菌落；(4)Berthelot初筛步骤，将2.5g氢氧化钠、18.7g磷酸氢二钠和15.9g磷酸钠溶于400mL水中，加入含250mg有效氯的次氯酸钠溶液；用水稀释，用磷酸或磷酸钠调节pH为11.7，最后定容至500mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液，即A液，将5.0g苯酚和0.025g亚硝基铁氰化钠溶于450mL水中，用水稀释定容至500mL，制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液，即B液，取菌体催化样品待测样1μL，加入A液、B液各50μL以及100μL双蒸水，混合均匀，37℃恒温并震荡反应20min，测定612nm处吸光度；(5)高压液相复筛步骤：使用仪器为：Waters 2545HPLC(Milford，MA，USA)，色谱柱为Aminex HPX‑87H(300mm×7.8mm，USA)。色谱条件为：进样量为10μl，流动相为0.005M H2SO4，流速为0.3～0.5ml min‑1，柱温为35℃。