[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV6L1蛋白的方法

摘要

本发明涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV6L1蛋白的方法。具体地，本发明公开了产生表达HPV6L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV6L1蛋白的方法以及所产生的HPV6L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。

主权项

一种产生HPV6 L1蛋白的方法，包括以下步骤：a)产生表达人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞；b)在适于所述HPV6 L1蛋白表达的条件下培养a)中获得的重组汉逊酵母细胞；c)从培养物中回收并纯化所述HPV6 L1蛋白；和d)对所纯化的HPV6 L1蛋白进行解聚和重聚，其中a)中通过包含以下步骤的方法产生表达人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞：a1)通过将包含与MOX启动子和MOX终止子可操纵地连接的SEQ ID NO:4所示的HPV6 L1蛋白编码序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQ ID NO:15的载体来构建表达构建体；a2)用步骤a1)中获得的表达构建体通过电穿孔转化ATCC26012汉逊酵母细胞；和a3)用Zeocin和G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有拷贝数大于30的所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞；其中b)中的培养包括以下步骤b1)和b2)：b1)制备发酵种子液：取所述重组汉逊酵母细胞冻存甘油菌80μl接入5ml YPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养18‑24hr至A600nm3‑5，吸取1ml接入500ml YPD培养基中，于37℃、200rpm摇床培养18‑24hr至A600nm15‑20，作为发酵种子液待用；b2)发酵：2x500ml发酵种子液加入至30L发酵罐中的发酵起始培养基，发酵体积为15L；起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm3/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20‑80％；起始生长期维持22hr后，菌液A600nm达到20，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基；培养6‑8hr后，菌液A600nm达到90，停止流加，氨水调节pH值至6.0；溶氧开始回升后开始流加甲醇进入诱导表达期，甲醇初始流加速率为50ml/hr，每小时取样，甲醇电极测定甲醇浓度，通过调节甲醇流加速率控制甲醇浓度＜5g/L；诱导10hr后下罐，4℃条件下以5000rpm离心30min收集湿菌体并‑20℃冻存；其中c)中的回收和纯化包括以下步骤c1)和c2)：c1)取‑20℃保存的湿菌体，按照10ml/g湿菌体的比例加入0.9％生理盐水清洗；菌体洗涤后，按20ml缓冲液/g湿菌体加入破碎缓冲液充分溶解，使用高压匀浆破碎，破碎压力1500bar，循环破碎6‑8遍，镜检破碎率＞90％；菌体破碎液在4℃条件下以9000rpm离心30min，收集上清液，再加入45％硫酸铵，沉淀30min后，4℃条件下9000rpm离心30min，收集上清液；c2)经1μm过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质POROS 50HS，以0.5M‑1.5M NaCl梯度洗脱，收集洗脱的HPV6 L1蛋白；将初纯的HPV6 L1蛋白上样于层析介质Macro‑Prep陶瓷羟基磷灰石，用20‑200mM磷酸盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的HPV6 L1蛋白；其中d)中的解聚和重聚包括以下步骤：纯化后的HPV6 L1蛋白加入25mM DTT，0.05％的Polysorbate80，于pH8.2条件下，在室温解聚2小时；针对1.0M NaCl，20mM磷酸盐，0.05％Polysorbate80，pH 7.2的透析体系按1:100比例透析3次，每次30min，去除DTT；再针对1M NaCl,5mM Ca2+，60mM柠檬酸钠，pH6.2，0.05％Polysorbate80的透析体系透析到重聚缓冲液中；于4℃，透析24小时后获得重聚的HPV6 L1蛋白。