[发明专利]基于SNP基因分型技术的金银花药材真伪鉴别方法

摘要

本发明是利用SNP分型技术鉴别中药材金银花真伪的办法。通过利用单核苷酸位点变异设计的鉴别引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别金银花及其常见伪品红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬等。通过DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对金银花的真伪鉴别。

主权项

一种基于SNP基因分型技术的金银花药材真伪鉴别方法，其特征在于DNA模板提取、高特异性的聚合酶链式反应(PCR)扩增、电泳检测三个方面：①模板DNA的提取：选取无霉变的干燥药材标本0.1g，置于粉碎机中研磨粉碎至可过40目筛；将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB，100mmol/LTris‑Hcl pH＝8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/L Nacl)、0.02g PVP 40000、10μLβ‑巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h‑2h，期间轻摇2‑3次；结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿‑异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min；取上清，加入等体积氯仿‑异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min；取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，‑20℃放置0.5h以上；取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，‑20℃保存；②PCR扩增：PCR反应体系25μL含2.5μL 10×Ex taq缓冲液、2μL 0.25mmol/L dNTPs，两种高度特异性鉴别引物Lj‑F即5’‑GTTGACTGTCCTGTGTTGGT‑3’和Lj‑R即5’‑GGATGAGAAATATAACGAATTTAG‑3’，各0.25pmol，0.8U Ex taq DNA聚合酶，约30ng DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸7min；反应结束后4℃保存；③电泳检测：PCR反应设置无模板DNA的阴性对照，反应结束后取4μL反应液，与2μL 6×上样缓冲液充分混匀，于1.5％的EB染色的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在480‑490bp范围内扩出明亮唯一条带的为正品金银花，混淆品均无任何条带扩出。