[发明专利]一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法

摘要

一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法，包括引物设计及合成、单孢子堆DNA的提取、目的基因的扩增及分离、对扩增终产物进行分离鉴定，后进行测序，并在Genbank进行比对，确定为小麦锈病单孢子堆。本发明利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法，其鉴定方法操作简单，鉴定结果迅速准确，可以应用到实际生产中。

主权项

利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法，其特征在于：其方法步骤为：1）单孢子堆获取：取干净、无菌的培养皿，在培养皿的皿底垫三层滤纸，加入无菌去离子水，使滤纸湿润，将含有滤纸的培养皿放置在紫外灯下，消毒20分钟，备用；2）用20μL的移液枪吸取5μL无菌去离子水，将去离子水打出在移液枪的枪头顶端形成一个水球，然后用水球在染病的小麦叶片上蘸取一个单孢子堆，将含有单孢子堆的无菌去离子水注入无菌的0.5mL PCR管Ⅰ中，将0.5mL PCR管Ⅰ开口放入步骤1）中的培养皿中，备用；3）含有单孢子堆的0.5mLPCR管Ⅰ置于25℃条件下，培养24小时，使孢子萌发，后取出含有孢子的0.5mL PCR管Ⅰ，将其置于‑20℃条件下，放置24小时，取出，在含有孢子的0.5mL PCR管Ⅰ内加入10μL的灭菌细石英砂，研磨均匀，得到匀浆液，备用；步骤二、引物的设计及合成设计并合成外引物ITS1‑F、外引物ITS4‑B及内引物ITS1、内引物ITS4，其外引物及内引物的序列如下：ITS1‑F：5'‑CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA‑3'ITS4‑B：5'‑CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG‑3'ITS1：5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3'ITS4：5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3'步骤三、利用外引物进行第一次PCR扩增1）取2.0μL的10倍缓冲液、0.5μL的dNTP、0.5μL的外引物ITS1‑F、0.5μL的外引物ITS4‑B、0.5μL的Taq聚合酶和16μL的双蒸水，混合均匀，形成PCR反应液Ⅰ，备用；1）在含有匀浆液的0.5mL PCR管Ⅰ内加入20μL 步骤1）中的PCR反应液Ⅰ，以转速为2000转/分钟，涡旋混匀10分钟，然后将PCR反应液Ⅰ甩至PCR管底部，混合均匀，形成混合液Ⅰ，备用；2）将含有混合液Ⅰ的0.5mLPCR管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物Ⅰ，备用；步骤四、利用内引物进行第二次PCR扩增    1）取2.0μL的10倍缓冲液、0.5μL的dNTP、0.5μL的内引物ITS1、0.5μL的内引物ITS4、0.5μL的Taq聚合酶和16μL的双蒸水，混合均匀，形成PCR反应液Ⅱ，备用； 2）取第一次PCR扩增的扩增产物Ⅰ，将其分别稀释为1倍PCR扩增模板、1/10倍PCR扩增模板和1/100倍PCR扩增模板，取3个0.5 mLPCR管，在每个0.5 mLPCR管内分别加入三种不同稀释倍数的PCR扩增模板，每种PCR扩增模板的加入量为1 μL，然后分别在每个0.5 mLPCR管内加入24 μL步骤1）中得到的PCR反应液Ⅱ，分别将3个0.5mLPCR管以转速为700转/分钟，混匀1分钟，然后将PCR反应液Ⅱ甩至PCR管底部，混合均匀，分别形成混合液Ⅱ‑a、混合液Ⅱ‑b和混合液Ⅱ‑c，备用；3）分别将含有混合液Ⅱ‑a、混合液Ⅱ‑b和混合液Ⅱ‑c的3个0.5mLPCR管放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共重复35次，最后72℃再次延伸10分钟，取出，分别得到扩增产物Ⅱ‑a、扩增产物Ⅱ‑b和扩增产物Ⅱ‑c，备用；步骤四、扩增终产物的分离、鉴定1）利用琼脂糖凝胶电泳检测分别对扩增产物Ⅱ‑a、扩增产物Ⅱ‑b和扩增产物Ⅱ‑c进行电泳检测，在凝胶成像系统中确认含有623bp目的条带的扩增产物，将含有623bp目的条带的扩增产物，取出，备用；2）用DNA凝胶回收试剂盒对含有目的条带的扩增产物进行回收、纯化取1.5mLPCR管Ⅱ并称其重量，在紫外灯下将含有目的条带的扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的含有目的条带的扩增产物放在已称重的1.5mLPCR管Ⅱ中，称取1.5mLPCR管Ⅱ的总重并计算出从凝胶上切下来的含有目的条带的扩增产物的重量，然后将1.5mLPCR管Ⅱ中含有目的条带的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5mLPCR管Ⅱ放置在50ºC水浴中加热至含有目的条带的扩增产物完全融解，得到混合液Ⅲ，将混合液Ⅲ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700μL的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500μL的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5mLPCR管Ⅲ中，后在DNA纯化柱上加入40μL洗脱液，将1.5mLPCR管Ⅲ在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5mLPCR管中Ⅲ中的液体，备用； 3）将步骤2）中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为小麦叶锈病原菌‑‑小麦隐匿柄锈菌（Puccinia recondita）； 所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。