[发明专利]一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法

摘要

本发明公开了一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，这种方法的研究对象规格小，研究对象无需处死，可早期选育目标经济性状，提高育种效率，且提取DNA的组织材料的用量极少，提取的DNA质量好，能满足生物学研究需求；其技术要点是：这种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法包括以下步骤1)幼蚌外套膜组织的剥离；2)剥离组织基因组DNA的提取；3)提取DNA的检测；4)幼蚌培育。

主权项

一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，包括以下步骤：1)幼蚌外套膜组织的剥离：选取脱苗后50天的幼蚌20只，分成实验组和对照组，每组各10只，对幼蚌进行标记，并记录每只幼蚌的体长和体重；用刀片轻轻撬开实验组幼蚌蚌壳2～3mm，沿边缘划取外套膜组织，取样2mg，用镊子夹取至离心管中；2)剥离组织基因组DNA的提取：a.在上述离心管中加入200μl裂解液，55℃水浴消化至澄清，轻轻摇匀数次；b.之后加入200μl苯酚，轻微翻转混合10min后，12000r/min离心20min，用前端剪掉1cm的粗口枪头吸取上清液至新的离心管；c.重复步骤b，之后加入200μl苯酚‑氯仿‑异丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和异丙醇的体积比为25∶24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；d.之后加入200μl氯仿‑异丙醇混合液，其中氯仿和异丙醇的体积比为24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；e.之后加入两倍于离心管中溶液体积的无水乙醇，其中无水乙醇的温度为‑20℃，然后于‑20℃冰箱中静置至少30min，12000r/min离心20min，倒掉溶液；f.在离心管中加入70％乙醇200μl，洗涤两次，之后倒掉离心管中的液体，室温晾干；g.待酒精挥发完全后，加入80μl无菌水，4℃冰箱中溶解至少4小时；3)提取DNA的检测：用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，DNA大分子条带清晰明亮；分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的浓度在42～130ng/μl，DNA含量在3360ng以上，OD260/OD280值在1.8以上；4)幼蚌培育：将取样后的幼蚌放入1L浓度为0.01mg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分钟后与对照组幼蚌均匀洒在底部铺有2cm细泥沙的培育池中，将富含浮游生物的水注入培育池中对幼蚌进行流水培育，并保持水流平稳以减少刺激，直至幼蚌达到稳定生长状态，一个月后，对实验组和对照组幼蚌生长数据进行T检验和SNK检验，结果均显示实验组和对照组幼蚌的生长无显著差异。