[发明专利]检测结核分枝杆菌（TB）的耐药基因突变型的方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个耐药位点，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。

主权项

一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法，其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因选自KatG、inhAregulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA中，所述方法包括：1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的耐药基因突变型设计的特异性针对每种耐药基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，所述扩增引物在3′端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17‑25个碱基，在5′端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物；2)质谱延伸引物的制备：质谱延伸引物的长度为17‑28个碱基并且其3′端位于耐药基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耐药基因突变位点；3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；7)纯化步骤6)中获得的延伸产物；8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测，所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。