[发明专利]一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法

摘要

本发明公开了一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，该方法包括以下步骤：步骤10.制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括制备磁性纳米颗粒、制备表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液和制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液。步骤20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺。步骤30.洗脱步骤20制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒。该方法采用磁性纳米颗粒表面的磺化壳聚糖来稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，利用磁性纳米颗粒的磁分离功能，从生物介质中分离和洗涤儿茶酚胺，过程简单快速、成本低廉、富集率高。

主权项

一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤101、102和103：制备磁性纳米颗粒，该步骤包括步骤1011、1012和1013：1011．将摩尔比为2:1的Fe3+和Fe2+投料：用浓度为2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解三氯化铁，将盐酸和三氯化铁形成的混合溶液加入至反应釜中，通入氮气搅拌，形成三氯化铁盐酸溶液；再用浓度为2mol/L的盐酸溶液超声溶解硫酸亚铁，形成硫酸亚铁盐酸溶液；将硫酸亚铁盐酸溶液与三氯化铁盐酸溶液混合搅拌，形成混合铁盐溶液；1012．将质量百分比浓度为12.5%的四甲基氢氧化铵水溶液加入步骤1011制备的混合铁盐溶液中，用蠕动泵搅拌，同时通入氮气；然后进行磁分离洗涤，得到黑色沉淀；1013.进行氧化和表面修饰：首先，用2 mol/L 的盐酸溶液稀释步骤1012制得的黑色沉淀，并调节pH值为3，超声搅拌直至pH值稳定；其后，将盐酸溶液稀释黑色沉淀后所形成的溶液加入反应釜中进行油浴加热搅拌,反应体系温度为90℃，同时用空气泵鼓入空气，进行氧化反应1 h —5h，然后磁分离洗涤，从而制得磁性纳米颗粒；制备表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤1021、1022和1023：1021．用蒸馏水稀释步骤101制备的位于反应釜中磁性纳米颗粒，形成磁性纳米颗粒胶体溶液，然后用盐酸溶液调节该磁性纳米颗粒胶体溶液的pH值为2.7，超声搅拌直至pH值稳定；1022.按照磁性纳米颗粒与2，3‑二巯基丁二酸的摩尔比1—1.5，称取2，3‑二巯基丁二酸，将2，3‑二巯基丁二酸超声溶解于二甲基亚砜溶液中，然后将溶解了2，3‑二巯基丁二酸的二甲基亚砜溶液加入步骤1021制得的pH值为2.7的磁性纳米颗粒胶体溶液中，搅拌反应1h—5h；1023.步骤1022的搅拌反应结束后，对步骤1022中溶有2，3‑二巯基丁二酸和二甲基亚砜溶液的磁性纳米颗粒胶体溶液进行磁分离，形成含表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒的混合反应溶液；用四甲基氢氧化铵水溶液调节该混合反应溶液的pH为10，超声直至pH稳定为10；然后将该混合反应溶液的pH值调回为7，进行定容透析，得到表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液；103.先包覆后磺化，制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液：该步骤包括步骤1031、1032和1033：1031.按照壳聚糖与铁的重量比为2—8，在40‑80 ℃的恒温下，将壳聚糖溶解在体积比为1%‑10%的醋酸水溶液中，搅拌至澄清，形成壳聚糖溶液；用水稀释步骤1023制得的表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，形成表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液；1032.启动搅拌机，将步骤1031制备的壳聚糖溶液加入步骤1031制备的表面包裹2，3‑二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液中，持续搅拌2 h —20 h；然后磁分离、用水洗涤后，加水磁分离16 h —24 h；将上层水倒掉，取出下层黑色粒子，在90‑120℃烘干该黑色粒子6‑12小时，该黑色粒子为表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒；1033.将步骤1032制备的表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒加入质量百分浓度为90‑98%的硫酸溶液中，然后用搅拌机搅拌该硫酸溶液2‑8小时后，用无水乙醇萃取一次，再加入无水乙醇静置6‑20小时，吸出上清液后，向下层奶白色乳状液体中加入重量百分浓度为10%的氢氧化钠溶液，再用重量百分浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH值为6‑9之间，形成磺化溶液；将该磺化溶液加水稀释后，用离心机分离，下层絮状物加水超声溶解，得到表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液；    20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，包括步骤201、202和203：201.用涡旋仪将步骤1033制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液涡旋，并超声10‑60min；202.将生物介质样品溶液加入离心管，并加入100μL的步骤201制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，避光涡旋1‑5min，超声5‑20min后再静置10‑60min，形成待测混合溶液；203.将步骤202制得的待测混合溶液离心10‑60min，转速为9000‑16000r/min，下层所沉积的黑色颗粒为富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒；洗脱步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒：首先，将步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒进行磁分离和水洗涤；然后，使用洗脱剂于富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒中，用涡旋仪避光涡旋1‑5min，用超声仪超声3‑20min，静置10‑60min后，用离心机离心10‑60min，转速为9000‑16000r/min，上清液进样含有洗脱的儿茶酚胺。