[发明专利]一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法

摘要

本发明提供了一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，即采用冰冻破碎匀浆法和漩涡混合法，对提取的绵羊肝、脾、肺、肾等内脏组织蛋白进行蛋白定量，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白进行分离，利用Westernblot检测转基因绵羊绿色荧光蛋白GFP基因的表达；其技术特点：1、所提取的蛋白浓度高，成本低廉；2、适应成年或幼年羊的内脏组织蛋白的提取；3、难溶性蛋白少，丢弃的组织残渣少，具有重要的实用价值。

主权项

1.一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，其特征在于：以绵羊肝、脾、肺、肾的内脏组织为样品，按细胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤实施：细胞破碎：称取20-25mg样品，剪成3mm×3mm的小块，置于预冷的2mL离心管中，其样品与裂解液的加量比为1:3-1:5；继续加入直径为4-5cm的无菌钢珠，置于TissueLyserLT仪器中匀浆，匀浆40-50秒即粉碎，取出钢珠，置于冰盒中3分钟，在漩涡振荡器上涡旋10秒，再置于冰盒、再涡旋，反复6-8次，使其充分溶解；取匀浆液在4℃、14000转/分钟、离心25-30分钟，取上清得蛋白提取物；其中LT仪器在使用前先置于-70℃冰箱预冷;蛋白定量：以BSA为对照，选用BCA法，依据多功能酶标仪的检测结果，制定标准曲线，以计算蛋白浓度将其定量；取定量蛋白100μg，加入等量2×上样buffer，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白；其中蛋白裂解液的配方：取9M尿素2.7克，质量体积比为4﹪3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.2克，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20℃冰箱中，使用前在裂解液中加入体积比为4﹪的蛋白酶抑制剂；其中2×上样buffer的配方：取20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH为8.0,100mM二硫苏糖醇，2％十二烷基磺酸钠，20％丙三醇，0.016％溴酚蓝，依次加入试剂瓶中完全溶解后使用;其中电泳检测蛋白：将凝胶放入电转缓冲液中，用湿转法100V转印60min，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，用一抗为GFP单抗1∶400稀释，在4℃孵育12-14h，PBST洗涤5次，每次10min，用二抗为IRDye800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1∶12000稀释，室温下孵育50min，用PBST洗涤5次，每次10min，再用PBS洗涤一次，采用Odyssey近红外双色激光扫描成像。