[发明专利]神经坏死病毒的RT-PCR检测方法

摘要

神经坏死病毒的RT-PCR检测方法，涉及病毒的检测方法。提供神经坏死病毒的RT-PCR检测方法、神经坏死病毒的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法。神经坏死病毒的RT-PCR检测方法：RT-PCR引物设计；含有检测目的片段重组质粒pSP-NNV的构建和作为阳性对照的小RNA片段的制备；引物的特异性实验和灵敏度检测实验；回收率实验和方法有效性实验。试剂盒设有盒体和检测试剂，检测试剂设有裂解液、吸附液、洗涤液、重蒸水、RT-PCR混合反应液、NNV-PCR反应液、阳性对照、阴性对照、RNA提取和RT反应管。试剂盒的制备方法：配制检测试剂；将检测试剂置入盒体内。

主权项

1.神经坏死病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：一、RT-PCR引物设计根据已获得的NNV外膜蛋白基因序列，使用软件Primer Premier 5设计5条用于建立检测方法的引物，所述引物序列如下表所示：二、含有检测目的片段重组质粒pSP-NNV的构建和作为阳性对照的小RNA片段的制备在体外构建用于体外转录的重组质粒pSP-NNV，然后体外转录获得小RNA片段；三、引物的特异性实验和灵敏度检测实验1)特异性检测分别使用胰脏坏死病毒IPNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、病毒性出血性败血症病毒VHSV和鲤春血症坏死病毒SVCV的RNA为模板进行RT-PCR实验或者使用自流行性造血器官坏死病毒EHNV和大黄鱼虹彩病毒LYCIV的DNA为模板进行PCR实验；RT-PCR和PCR反应条件和程序如下：混合均匀后42℃反应1h，70℃反应15min终止反应后迅速置于冰上，然后将获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：PCR程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min；2)灵敏度检测实验检测该方法的敏感性，分别取不同浓度梯度的作为阳性对照的RNA 2μl为模板进行RT-PCR，逆转录和PCR条件和程序同特异性实验，然后使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；四、回收率实验和方法有效性实验：1)回收率实验将20μl 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴拷贝/μl的阳性对照RNA和100mg未感染的鱼脑组织混合，使用TRIzol按说明书提取RNA，再将RNA溶解在20μl DEPC处理水中，然后分别用2μl阳性对照RNA和新提取的RNA作为模板进行RT-PCR检测，逆转录和PCR条件和程序同特异性实验，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；2)方法有效性实验将2μl 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴拷贝/μl的阳性对照RNA和2μl未感染鱼RNA混合作为模板进行RT-PCR，并以同浓度的阳性对照RNA与同体积的DEPC处理水混合作为模板作为对照，逆转录和PCR条件和程序同特异性实验。