[发明专利]一种土壤微生物cDNA文库的构建方法

摘要

本发明提供了一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，本发明的构建方法先将总RNA逆转录成单链的cDNA，单链cDNA的5’端经去磷酸化后与5’端磷酸化修饰的接头1连接，再将5’端连有接头的cDNA进行磷酸化反应，反应后的cDNA的3’端与接头2连接，获得5’、3’端分别连接有接头的cDNA，采用与接头部分序列互补的寡核苷酸作为引物对cDNA进行扩增，从而获得土壤微生物的双链cDNA，将此双链cDNA与克隆载体pMD-18T连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得土壤微生物的cDNA文库。本发明构建的土壤微生物cDNA文库库容量较大，可以用来筛选感兴趣的目的基因，以及后续的基因、蛋白互作分析。

主权项

一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5’端接头连接，3’端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：（1）土壤微生物总RNA获得：提取获得土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA纯化后备用；（2）总RNA的逆转录：总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 、pH=5.2的醋酸钠溶液，于‑20℃下沉淀12 h；（3）cDNA 5’端接头连接：纯化后的cDNA 用碱性磷酸酶进行5’的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5’接头1进行连接，连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的的3M、pH=5.2的醋酸钠溶液，于‑20℃下沉淀12h；其中接头1：5'‑CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT‑3'，5’端经磷酸化修饰；（4）cDNA 3’端接头连接：连有5’接头cDNA的3’端用T4多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3’接头2进行连接；其中接头2： 5'‑CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT‑3'；（5）PCR扩增：分别连接有3’端和5’端接头的cDNA用接头的互补引物P1：5'‑TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT‑3' ，P2：5'‑AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT‑3' 进行扩增，具体的反应参数为：95℃ 1 min，94℃ 1 min、65℃ 30sec、72℃ 2 min 30sec共30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；（6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产物经纯化后，与pMD‑18 T载体进行连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得cDNA文库。