[发明专利]细菌耐药基因检测芯片及其应用

摘要

本发明涉及的是一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用。基因芯片含有117条基因探针，耐药基因探针选自17大类耐药基因，包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因。该芯片用于病原菌耐药基因的检测。其特征在于芯片包括（1）17大类耐药基因的117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。

主权项

一种细菌耐药基因检测芯片，其特征在于基因检测芯片包括（1）17大类耐药基因的117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种耐药基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；所述的细菌耐药基因检测芯片是指能检测17大类耐药基因的寡核苷酸阵列，17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位；所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；所述的检测17大类耐药基因的117条寡核苷酸基因探针如下:整合酶类基因探针选自Ⅰ类整合酶基因（IntI1）和Ⅱ类整合酶基因（IntI2），每个基因选取正负链探针各一条,共4条探针：intI1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGC‑3'intI1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG‑3'intI2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG‑3'intI2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG‑3'四环素家族耐药基因探针选择tetM基因,设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针：tetM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA‑3'tetM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA‑3'氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有aac(3)‑I、aac(3)‑II、aac(3)‑III、aac(3)‑IV、aac (6')‑I、aac(6')‑II、aphA6， ant(3')‑I和ant(2'')‑I共9种，每个基因选取正负链探针各一条, 共18条探针：aac(3)‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC‑3'aac(3)‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG‑3'aac(3)‑II基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT‑3'aac(3)‑II基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC‑3'aac(3)‑III基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATGCTTG‑3'aac(3)‑III基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC‑3'aac(3)‑IV基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT‑3'aac(3)‑IV基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG‑3'aac (6')‑Ib基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTTTAGCG‑3'aac (6')‑Ib基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCC‑3'aac (6')‑II基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC‑3'aac (6')‑II基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTTCGTC‑3'aphA6基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAGAGCCA‑3'aphA6基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTATTTGGC‑3'ant( 3')‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATG‑3'ant( 3')‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG‑3'ant(2'')‑I基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCTCACTC‑3'ant(2'')‑I基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCCCAGC‑3'耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：qacA/B基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA‑3'qacA/B基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC‑3'红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：ErmA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT‑3'ErmA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG‑3'ErmB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC‑3'ErmB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT‑3'ErmC基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTG                  GC‑3'ErmC基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTC‑3'大环内酯类外排（mefA）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：mefA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA‑3'mefA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA‑3'耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB、VanC1、VanC2、VanD，VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针：VanA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT‑3'VanA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA‑3'VanB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT‑3'VanB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA‑3'VanC1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG‑3'VanC1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC‑3'VanC2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC‑3'VanC2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA‑3'VanD基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA‑3'VanD基因负链探针5'‑NH2‑T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC‑3'VanE基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG‑3'VanE基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA‑3'多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB‑ TolC，OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：AcrAB‑TolC基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGT‑3'AcrAB‑TolC基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAGACGC‑3'OprM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG‑3'OprM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG‑3'Sme DEF基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT‑3'Sme DEF基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG‑3'耐莫匹罗星（ileS）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：ileS基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA‑3'ileS基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC‑3'磺胺类耐药基因探针，选择了dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：dfrA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAAGCT‑3'dfrA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT‑3'dfrD基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGACATTC‑3'dfrD基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCATGTCCT‑3'泰洛星（tlrB）耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：tlrB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC‑3'tlrB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC‑3'氟喹诺酮类（norA）药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针：norA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA‑3'norA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG‑3'β内酰胺酶类（BLA）耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌（MRSA）金标准mecA基因；其中超广谱β内酰胺酶（ESBLs）耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、SHV型、CTX‑M型（由于各亚型间CDS核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组），PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针：TEM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA‑3'TEM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA‑3'SHV基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA‑3'SHV基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC‑3'CTX‑M1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA‑3'CTX‑M1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC‑3'CTX‑M2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA‑3'CTX‑M2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT‑3'CTX‑M3基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC‑3'CTX‑M3基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT‑3'PER基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG‑3'PER基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG‑3'VEB基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA‑3'VEB基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT‑3'头孢菌素酶（AmpC）耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针：AmpC基因正链探针第一条5'‑NH2‑T(10)AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC‑3'AmpC基因负链探针第一条5'‑NH2‑T(10)GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT‑3'AmpC基因正链探针第二条5'‑NH2‑T(10)CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC‑3'AmpC基因负链探针第二条5'‑NH2‑T(10)GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC‑3'AmpC基因正链探针第三条5'‑NH2‑T(10)CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC‑3'AmpC基因负链探针第三条5'‑NH2‑T(10)GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAATAAA‑3'AmpC基因正链探针第四条5'‑NH2‑T(10)TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA‑3'AmpC基因负链探针第四条5'‑NH2‑T(10)AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACCGATA‑3'AmpC基因正链探针第五条5'‑NH2‑T(10)CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC‑3'AmpC基因负链探针第五条5'‑NH2‑T(10)CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCAAAC‑3'AmpC基因正链探针第六条5'‑NH2‑T(10)CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATAAGCC‑3'AmpC基因负链探针第六条5'‑NH2‑T(10)AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC‑3'碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMP1型及通用型、OXA23型、OXA24型，VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针：IMP基因通用正链探针5'‑NH2‑T(10)CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTG                    TGG‑3'   IMP1基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT‑3'IMP1基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC‑3'OXA23基因正链探针5'‑NH2‑T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC‑3'OXA23基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT‑3'OXA24基因正链探针5'‑NH2‑T(10)AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT‑3'OXA24基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC‑3'VIM基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG‑3'VIM基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC‑3'GES2基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC‑3'GES2基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG‑3'MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针：mecA基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG‑3'mecA基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACT‑3'常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶（Cat）基因、博莱霉素（ Zeocin ）基因、杀稻瘟菌素（Bsr）基因、嘌呤霉素（Puromycin）基因、卡那霉素（Kana）基因，氨苄霉素（Amp）基因和四环素（Tet）基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针：Cat基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC‑3'Cat基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT‑3'Zeocin基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT‑3'Zeocin基因负链探针5'‑NH2‑T(10)TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG‑3'Bsr基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA‑3'Bsr基因负链探针5'‑NH2‑T(10)AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA‑3'Puromycin基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT‑3'Puromycin基因负链探针5'‑NH2‑T(10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT‑3'Kana基因正链探针5'‑NH2‑T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG‑3'Kana基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT‑3'Tet基因正链探针5'‑NH2‑T(10)CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG‑3'Tet基因负链探针5'‑NH2‑T(10)CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA‑3'Amp基因正链探针第一条5'‑NH2‑T(10)CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA‑3'Amp基因负链探针第一条5'‑NH2‑T(10)CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA‑3'Amp基因正链探针第二条5'‑NH2‑T(10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC‑3'Amp基因负链探针第二条5'‑NH2‑T(10)CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT‑3'。