[发明专利]中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法

摘要

本发明涉及中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，步骤是：将饥饿两天活蜗牛敲碎，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取消化液并作净化处理得上清液，配备成消化酶溶液；选用兰花果实作消毒处理，取出种子粉粒，将其中的原生细胞胚粉粒倒入消化酶溶液浸泡到翅羽状种皮开始降解时过滤原生细胞胚粉粒；将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体培养基中，稀释并接种于试管中的基础固体营养基上；试管25℃恒温在旋转床上震荡暗培养，让细胞胚分离；在1300LX光强下每天照射12h，恒温25℃条件下静置培养，直到下部长出生长点；分化生根；炼苗移栽得种苗。本发明首开利用动物消化酶降解兰花原生细胞胚种皮先河，成功培育出了90余种珍稀国兰品种，细胞胚启动成功率达到75％，受试品种全部启动，解决了濒危珍贵物种人工育种的世界难题。

主权项

一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于它有如下步骤：(1)蜗牛酶消化酶的提取：从田间收集活的大蜗牛，饥饿两天用水冲洗干净，敲碎，小心剥去外壳，顺消化道剪开体壁，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用离心机离心分层，留上清液，弃掉沉淀物，过滤纯净上清液待用；(2)细胞胚预处理：选用未开裂的兰花果实，表面用75％的酒精灭菌，用10％次氯酸钠浸泡5～10分钟，取出用无菌水冲洗3次完成表面消毒，切开果子，将其中的原生细胞胚粉粒倒入消化酶溶液中25℃度浸泡30 50分钟，翅羽状种皮开始降解时，停止浸泡，用无菌水冲洗至少3次，用滤纸过滤原生细胞胚粉粒；(3)稀释：将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体培养基中稀释；(4)接种：将第(3)步含有细胞胚粉粒的液体培养液接种于试管中的基础固体营养基上：(5)暗培养：接种好的试管在25℃恒温状态下，在旋转床上震荡暗培养，直至可观察到细胞胚粉粒开始膨大，细胞胚有丝分离开始；(6)光照培养：接上步，此时转为在1300LX光强下，每天照射12h光照培养，恒温25℃条件下静置培养，直到试管内兰花根状茎(龙根)启动；(7)分化：将根状茎转接于分化固体营养基中，生长点朝下插入营养基，25℃光强2000LX条件下，培养60d左右生长点开始不断向下生长至2 3cm，根状茎开始转向折头向上生长，直至钻出固体营养基表面，这时生长点分化为芽点并长出子叶；(8)生根：将根状茎转接于壮苗生根固体营养基上，芽点朝上根状茎朝下，25℃光强2500LX条件下培养60d，根状茎与子叶交界处长出肉质气生兰根，子叶中心长出完整兰花苗；(9)炼苗移栽：将兰花苗连龙根一起从试管中移出，洗净根部附着的营养基，用1/1000浓度的多菌灵消毒后，晾干至气生根发白时，移栽至经高温消毒的腐质基质中。