[发明专利]一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法

摘要

本发明提供的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，1）针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为：5’-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P：5’-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’）；2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为50℃，计算分子信标S/B值；3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20x105cfu/μl，分子信标的浓度为10ng/μl。

主权项

一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：1）针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为：5’‑FAM‑ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT ‑DABCYL‑3’，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P：5’‑ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT‑3’）；2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为50℃，计算分子信标S/B值；3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20x105cfu/μl，分子信标的浓度为10 ng/μl；其中将金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的20 mM Tris‑HCl，pH 7.2缓冲液调至20x105cfu/μl浓度；其1菌体制备：吸取20x105cfu/μl的金黄色葡萄球菌2ml，10000 rpm离心5 min，收集菌体；加入6ml固定液，固定液为4%多聚甲醛+96% 20 mM Tris‑HCl，pH 7.2；4 ℃固定1h；离心10000 rpm，5 min，除去残留的多聚甲醛；用20 mM Tris‑HCl，pH 7.2缓冲液洗涤1次，得菌体沉淀物； 其2酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入1mg/ml溶葡萄球菌酶100 μl，37℃，15 min；收集菌体10000 rpm，5 min；分别用50%、80%、95%乙醇脱水3min；用20 μl 20 mM Tris‑HCl缓冲液重悬菌体，平均加入2个管中备用； 其3配制杂交缓冲液：在EP管中加入10μl100 ng/μl的MB和10μl100%的去离子甲酰胺后，用20 mM Tris‑HCl补足至100μl；对照缓冲液：在EP管中加入10μl100%的去离子甲酰胺后，用20 mM Tris‑HCl缓冲液补足至100μl，备用； 其4杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入100μl杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入100μl阴性对照缓冲液；2个管置于50 ℃，避光杂交2h，2个管分别收集菌体10000 rpm，5 min；2个管分别加入不含探针的100 μl缓冲液，于48 ℃洗涤15min；2个管分别重悬于500μl缓冲液中，置于冰上，3h内取样，过滤后测定。