[发明专利]一种MICB基因分型的PCR-SBT方法及试剂盒

摘要

本发明提供一种MICB基因分型的PCR-SBT方法及试剂盒。对MICB基因位点2-5外显子进行基因分型，包括以下步骤：(1)制备人类基因组DNA；(2)使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段：MICB的2-5外显子及之间的内含子；(3)使用测序引物对步骤(2)所得的PCR产物进行扩增，然后对扩增出的产物进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；由于本发明MICB基因测序试剂盒以及测试条件的优化组合，有效的扩增MICB位点的2-5外显子的全长和部分内含子的寡聚核苷酸序列，并对相应外显子进行测序，从而能够精确的对其进行分型。

主权项

一种MICB基因分型的PCR‑SBT方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段MICB的2‑5外显子及之间的内含子；所述的扩增引物对为MICB‑F和MICB‑RMICB‑F：5’‑GGACAGCAGACCTGTGTGTTA‑3’MICB‑R：5’‑GGAGATGGGAAAGCTCCTTT‑3’；所述PCR扩增反应条件依次为：1)95℃5min；2)重复以下19个循环：94℃45s→65℃45s，每循环降低0.5℃→72℃2min；3)重复以下13个循环：94℃45s→55℃45s→72℃2min；4)72℃10min；5)4℃保持；所述PCR反应体系为20μl，其组成如下：浓度4ng/μl的DNA 10μl1.49μl PCR缓冲液，所述的PCR缓冲液配制方法：10ml PCR缓冲液含：0.8g氨基丁三醇，0.22g硫酸氨，0.67ml 1M氯化镁，用盐酸调节pH到8.8；1.49μl 5mM dNTP；0.5μl 10μM上游引物MICB‑F；0.5μl 10μM下游引物MICB‑R；0.49μl 10％牛血清蛋白；5.32μl 28％蔗糖/甲酚红染料；0.12μl 5U/μl TaqDNA聚合酶；加双蒸水补足体积；(2)、使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，然后对扩增出的各序列进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；所述的用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物；MICB‑CF1：5’‑GGACAGCAGACCTGTGTGTTA‑3’MICB‑CR2：5’‑CCCTGTGCTATGGATGCA‑3’MICB‑CF3：5’‑CAGGAGTCCACCCTTGACAT‑3’MICB‑CR4：5’‑GGAGATGGGAAAGCTCCTTT‑3’。