[发明专利]敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法

摘要

本发明涉及一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，是以敌百虫分子印迹聚合物膜作为人工抗体代替生物抗体，利用酶联免疫吸附测定原理，建立对敌百虫具有高灵敏度的仿生酶联免疫吸附检测方法。该方法的最低检出限为7μgL-1，大大低于最高残留限量值，且大大缩短了分析时间（比传统生物免疫分析缩短1.0h），适用于快速检测敌百虫。本发明制备的仿生抗体可以重复使用50次以上，成本大大降低；并且前处理简单，灵敏度高，实验操作简单，适用于各种食品中敌百虫的快速检测。

主权项

1.   一种敌百虫仿生免疫吸附检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将敌百虫溶于乙腈和水后与功能单体甲基丙烯酸MAA和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EGDMA按照1:2:2的摩尔比例和偶氮二异丁腈AIBN充分混匀，然后96孔酶标板上每孔加入200 μL上述混合液聚合反应18h；用v/v1:9冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱8h以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物膜；2）以分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加200μLPBS溶液（5倍PBS：Na₂HPO₄·12H₂O：68.8 g，NaH₂PO4：6.9 g，NaCl：45 g，加双蒸水至1L，pH值 6.7）；第2行酶标孔设为对照组，每孔只加200μL1:3000（v/v）辣根过氧化物酶标抗原稀释液；第3-8行酶标孔依次加入100 μL标样梯度稀释液，所述的标样梯度稀释液浓度分别为50000,10000, 2000, 400, 80和16 μg L-1，用PBS稀释，然后立即加入100 μL1:3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液；3）将上述96孔酶标板室温孵育1 h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST（5倍PBS：200 mL，10%的Tween-20：5mL，加双蒸水定容至1L；）洗板五次；再在每孔中加入150 μL底物液，室温下反应30 min，每孔再加入50 μL 1.25 mol L^-1硫酸，终止反应；所述的底物液由底物A和底物B组成；所述的底物A为：8.2 g无水醋酸钠，2.5 g β-环糊精，150 mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4℃保存；所述的底物B为：50 mg 3,3,5,5-四甲基联苯胺溶于5 mL二甲基亚砜，室温避光保存；使用前15分钟，14.6 mL底物A和0.45 mL底物B混合成所述的底物液；4）在双波长方式450-650 nm下用酶标仪读取96孔酶标板第1-8行吸光度值A；按照下列公式计算不同浓度敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率值：IC%＝×100式中：IC% —— 敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率；A_对照—— 对照孔平均吸光度值；A_样品—— 敌百虫标准液或样品提取液的平均吸光度值（3-8行）； A_空白——空白孔的平均吸光度值； 5） 以标准溶液浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线；6）将分析物粉碎，按重量体积比（g/mL）1：10加入PBS溶液超声提取3次，0.45μm滤膜过滤得样品提取液；重复步骤2-4操作，将步骤2）中样品提取液代替标样梯度稀释液，所述的样品提取液浓度分别为50000,10000, 2000, 400, 80和16 μg L-1，用PBS稀释；根据吸光度值由标准曲线计算出样品提取液抑制率以及分析物中敌百虫含量。