[发明专利]猪卵丘干细胞的分离方法

摘要

本发明公开了一种猪卵丘干细胞的分离方法。其方法是抽取青年母猪卵丘卵母细胞复合物，卵母细胞体外成熟培养后，消化脱离卵丘细胞，收集消化的卵丘细胞进行培养，待有细胞集落出现并形成较大的细胞集落后，消化传代接种到饲养层上，在含有细胞因子的培养液中进行培养，分离培养的卵丘干细胞具有鸟巢状细胞生长形态，细胞圆形、核较大，细胞表达干细胞特有的标记Oct4、Nanog、SSEA1，体外分化能够形成来源于三个胚层的神经细胞、肌肉细胞和肝脏细胞，结果显示从猪卵丘细胞中分离培养了卵丘干细胞。

主权项

一种猪卵丘干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)猪卵丘细胞的采集从青年母猪卵巢表面抽取直径3 6mm卵泡，挑选卵丘细胞包裹2层以上致密且胞质均匀的卵丘卵母细胞复合物，用TCM 199卵母细胞成熟液洗涤3遍，然后将每70 80个卵丘卵母细胞复合物移入24孔培养板中进行培养，每孔400μlTCM 199卵母细胞成熟液，成熟液上面覆盖石蜡油，在39℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中培养42±2h；成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物用1mg/ml透明质酸酶消化脱去卵母细胞周围的卵丘细胞，收集卵丘细胞用于猪卵丘干细胞的分离培养；(2)猪卵丘干细胞的分离与培养取采集到的猪卵丘细胞，经PBS液离心洗涤后，添加高糖的DMEM培养液于37℃条件下进行培养，待培养的纤维状卵丘细胞中间出现圆形细胞形成的细胞集落后，更换为含4μg/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，胰酶消化圆形细胞集落，接种消化的细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加4μg/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液继续培养，细胞每天半量换液，2 3d传代一次。