[发明专利]一种产皱胃酶乳酸克鲁维酵母工程菌株的构建方法

摘要

一种产皱胃酶乳酸克鲁维酵母工程菌株的构建方法，它涉及一种产皱胃酶工程菌株的构建方法。方法：扩增得到的GG799的PMR1基因插入质粒pBluescript-II中得重组质粒pBluescript-II-PMR1，然后插入Zeocin抗性编码基因得重组质粒pBluesk-Z-PMR1，线性化后再转化乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞，构建GG799 PMR1基因缺陷型菌株；优化犊牛皱胃酶基因并插入GG799表达载体pKLAC1中得重组质粒pKLAC1-S-chymosin，线性化后转化PMR1基因缺陷型GG799感受态细胞即完成。本发明中所得的重组乳酸克鲁维酵母可用来生产制造干酪用的重组皱胃酶。

主权项

一种产皱胃酶乳酸克鲁维酵母工程菌株的构建方法，其特征在于产皱胃酶乳酸克鲁维酵母工程菌株的构建方法按以下步骤进行：一、根据Genebank中发表的乳酸克鲁维酵母PMR1的基因序列设计上游引物和下游引物，然后以乳酸克鲁维酵母GG799基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得乳酸克鲁维酵母GG799的PMR1基因；二、乳酸克鲁维酵母GG799的PMR1基因和质粒pBluescript‑II同时用Sac I和Xho I进行双酶切，回收所需目的片段并进行连接，获得连接产物pBluescript‑II‑PMR1；三、连接产物pBluescript‑II‑PMR1转化大肠杆菌JM109感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆液体摇瓶培养后提取重组质粒pBluescript‑II‑PMR1，经PCR、酶切和测序鉴定后再用Avr II酶切重组质粒pBluescript‑II‑PMR1和含有Zeocin抗性编码基因质粒，回收所需目的片段连接得构建重组质粒pBluesk‑Z‑PMR1，将重组质粒pBluesk‑Z‑PMR1转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选阳性克隆用于重组质粒pBluesk‑Z‑PMR1的酶切鉴定和PCR鉴定；四、将重组质粒pBluesk‑Z‑PMR1分别用Sac I和Xho I进行线性化，回收并纯化双酶切产物，然后转化乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞，构建PMR1基因缺陷型乳酸克鲁维酵母GG799，所得重组菌株即为乳酸克鲁维酵母GG799 PMR1基因缺陷型菌株；五、按照乳酸克鲁维酵母密码子使用偏好性对野生型犊牛皱胃酶基因进行密码子优化，将其中稀有密码子换成高频率表达密码子，然后进行全基因合成，得优化犊牛皱胃酶基因，然后转入pMD18‑T载体，获得含有优化犊牛皱胃酶基因的pMD18‑T载体；六、用Sal I和Not I分别双酶切含有优化犊牛皱胃酶基因的pMD18‑T载体和乳酸克鲁维酵母GG799表达载体pKLAC1，回收纯化目的片段并进行连接得重组质粒pKLAC1‑S‑chymosin，所得连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆液体摇瓶培养后提取重组质粒pKLAC1‑S‑chymosin，经PCR、酶切和测序鉴定后再用Sac II进行线性化，回收并纯化酶切产物，然后采用化学法转化PMR1基因缺陷型乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞，获得含有多个含皱胃酶基因串连表达框的乳酸克鲁维酵母GG799 PMR1基因缺陷型转化株，即完成产皱胃酶乳酸克鲁维酵母工程菌株的构建；其中步骤一中上游引物的核苷酸序列为：5′‑GGCGAGCTCTGCAGTATATATGAGTGACA‑3′，下游引物的核苷酸序列为：5′‑GGTCTCGAGTTGAGGAGCTATATGAGTCC‑3′；步骤五中优化犊牛皱胃酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。