[发明专利]小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法

摘要

小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法。通过生物发酵法获得本菌的菌丝体和发酵液，经超声萃取，溶剂萃取后采用薄层色谱和气象色谱技术定量、定性检测苦马豆素。并通过形态学和分子生物学方法鉴定产苦马豆素内生真菌。结果显示，分离出的6株内生真菌中有一株内生真菌可产生苦马豆素，产量为16.7338mg/L。经鉴定，该菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。本发明与现有产苦马豆素菌种相比，其苦马豆素产量较高，生物发酵生产苦马豆素不影响草地生态环境，为解决苦马豆素来源问题，并提供菌种支持，从而为今后苦马豆素的工业化生产奠定理论基础，其发展前景广阔。

主权项

小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法，其特征在于，包括步骤：1)小花棘豆中内生真菌的分离：将小花棘豆表面灭菌，灭菌程序：先用75％乙醇漂洗30～60s，无菌水清洗3次，0.1％升汞溶液漂洗2～5min，无菌水冲洗，取最后一次冲洗所得无菌水滴入PDA培养基平板，25℃培养48h，观察培养基表面有无菌落生长，以此验证植物表面消毒是否彻底。将表面消毒彻底的样品剪成0.5cm×0.5cm组织块，植于PDA培养基，25℃培养3～5d，待组织创缘菌丝长出时，用接种针挑出菌丝并接入新的PDA培养基，纯化培养3～4次，得到纯化菌株，并予以编号。按照上述方法分离纯化得到的菌株，在弃除常见的青霉、黄曲霉、黑曲霉等杂菌后，分别接种于PDA试管斜面培养，于‑20℃冰箱作长期保存，PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL；2)内生真菌生物发酵：取上述分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基平板，25℃培养至处于对数生长期时，采用打孔计量法分别接入1号液体培养液，25℃发酵培养14d。1号液体培养液配方：蔗糖26g，磷酸氢二钾3g，硝酸钠3g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，酵母浸膏3g，水1000mL；3)发酵液及菌丝体中苦马豆素定性、定量检测：定性检测：采用薄层色谱法，收集发酵液，减压浓缩至膏状，酸碱处理，水饱和正丁醇萃取6～7次，收集正丁醇萃取液，减压浓缩后用95％无水乙醇溶解制成待检液备用，超声协助乙醇萃取菌丝体中此生代谢产物，收集萃取液，余下步骤同发酵液，制成待检液备用，采用薄层层析技术，用苦马豆素标准品作对照，待检液用毛细管点于自制硅胶GF254薄层板上，置于V氯仿∶V甲醇∶V氨水∶V水＝70∶26∶2∶2展开剂上行展开，展开结束后取出挥干，双氧水/醋酐乙醇/对二甲氨基苯甲醛“三步显色法”显色，观察待检样品在薄层板上的位置 和斑点颜色，记录颜色并计算Rf值；定量检测：采用气相色谱法，用吡啶溶解苦马豆素标准品并做梯度稀释，加硅烷化试剂混合，室温下作用20min，取样进行气相色谱测定，色谱条件为：柱温200℃，进样口温度300℃，FID检测器温度280℃，载气为氮气，载气压力200kPa，流速为2mL/min，进样量2μL，分流比60∶1(AT.SE‑54型毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm，中科院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心)。以苦马豆素对应峰面积为横坐标，苦马豆素浓度为纵坐标制作标准曲线，然后根据标准曲线方程，计算出样品中苦马豆素含量；4)产苦马豆素内生真菌鉴定：形态学鉴定：将菌种接种于PDA培养基，待菌落长至合适大小，观察菌落、菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征，采用插片法提取PDA培养基中自然生长态菌丝，中性树胶封片，置400倍显微镜下观察菌丝和孢子形态，并拍照记录。根据菌落、菌丝和孢子形态等特征参考《真菌鉴定手册》进行初步分类鉴定；分子生物学鉴定：提取内生真菌基因组DNA，采用真菌鉴定通用引物：ITS1(5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGC‑3’)和ITS4(5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’)扩增核糖体rDNA基因中的ITS序列，将目的序列于NCBI上进行BLAST，结合形态学鉴定结果选取同源性高的菌种，然后采用Mega4.0软件N‑J法进行聚类分析，自展次数1000次，构建内生真菌系统发育树进行种属归类，结合上述两种方法鉴定内生真菌种属关系；5)得出产苦马豆素内生真菌：通过上述方法鉴定出一株产苦马豆素内生真菌，该菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)，其发酵液中苦马豆素产量为16.7338mg/L。