[发明专利]鱼类染色体荧光原位杂交方法

摘要

本发明公开一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，是在获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本的基础上，应用荧光原位杂交技术(FISH)，以Biotin-16-dUTP为标记物，用切口平移法标记探针，杂交信号经过两级放大，将人的5.8S+28SrDNA探针清晰地定位在多倍体鱼类的染色体核仁组织区域(NOR)。可通过观察核糖体5.8S+28SrDNA在多倍体鱼类的染色体定位来比较分析多倍体的染色体倍性及核型，即分析多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍体还是异源多倍体。

主权项

一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.制备染色体分散良好的染色体玻片标本，‑80℃保存；b.将染色体玻片标本于65℃恒温干燥2小时，在4×SSC溶液中浸泡5min，取0.5mg/ml的RNase溶液100μL至染色体玻片标本上，用封口膜盖上载玻片，放入底部放有2×SSC溶液的湿盒中37℃，30min；然后揭掉封口膜，将染色体玻片标本放入4×SSC溶液中浸泡5min，再转入装有卡诺固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2×SSC溶液是DDW与20×SSC溶液体积比为9∶1的混合液，所述4×SSC溶液是DDW与20×SSC溶液体积比为4∶1的混合液；c.以人的5.8S+28SrDNA为探针，用Biotin‑16‑dUTP标记该探针，探针标记混合液涡流振荡混合轻离心后，15℃水浴120min，65℃10min，室温放置10min后4℃冷藏；加入纯化混合液，纯化混合液与探针标记混合液的体积比为70.5∶20，‑80℃静置20min，室温静置10min，4℃15000rpm离心15min，加入150μL70％酒精轻离心，去掉上清液室温干燥5min，加入去离子甲酰胺20μL，得纯化后的探针混合液冷藏备用；所述探针标记混合液组成为：0.4mol/ml dATP2μL，0.4mol/ml dGTP2μL，0.4mol/ml dCTP 2μL，10×buffer 2μL，1mol/mlBiotin‑16‑dUTP 1μL，100μg/ml人的5.8S+28S rDNA探针1μL，灭菌蒸馏水6.5μL，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3.5μL；所述纯化混合液是鲑鱼精子DNA和E.coli体积比为1∶1的混合液2μl、4mol/ml的醋酸铵2.5μL及100％酒精66μL的混合液；d.将c步骤冷藏备用的纯化后的探针混合液在75℃的水浴锅中10min，迅速置于冰盒中冷却10min；e.将b步骤所得染色体玻片标本放入含70％甲酰胺/2×SSC溶液中，于70℃水浴2min，迅速移入‑20℃预冷70％酒精的染色缸内10min，再移入100％的‑20℃预冷酒精内5min，空气干燥；f.将杂交混合液加入到经d步骤处理的纯化后的探针混合液中，体积比5∶12，涡流振荡混合轻离心，37℃恒温培养箱内预杂交30min后，再将其滴在染色体玻片标本上，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱内至少18h；所述杂交混合液是20mg/ml的BSA、20×SSC溶液、灭菌蒸馏水及50％硫酸葡聚糖的体积比为1∶1∶1∶2的混合液；g.揭掉封口膜洗脱，洗脱过程为经50％甲酰胺/2×SSC溶液中42℃水浴锅中20min→2×SSC溶液室温20min→1×SSC溶液室温20min→4×SSC溶液室温5min；所述1×SSC是DDW与20×SSC体积比为19∶1的混合液；h.取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml信号放大混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光培育1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；再取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；所述10μg/ml检测试剂混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的avidin‑FITC溶液，所述信号放大混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的biotin/anti‑avidin溶液；i.把染色体玻片标本放在2×SSC溶液中清洗5min，用吸水纸吸去染色体玻片标本表面多余的2×SSC溶液，在有染色体处滴入50μL2.5μg/ml的DAPI荧光染液，盖上盖玻片并封片，平放在载玻片夹中4℃冷藏；所述DAPI荧光染液是母液、缓冲液和DABCO体积比为1∶5∶15的混合液，所述母液是将10mgDAPI溶在1000ml的蒸馏水中，所述缓冲液的组成为：0.12414gTris、0.37225g EDTA‑2Na及0.5844gNaCl溶于100ml蒸馏水中。