[发明专利]一种基于片段长度分析的甲基化DNA检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，合成带有尾引物序列的正向和反向引物；步骤3，以特定的DNA聚合酶对待测DNA样品进行PCR扩增；步骤4，以带有荧光标记的尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，进行PCR产物的片段长度测定分析，判定样品中是否存在甲基化DNA。本发明甲基化DNA检测方法，具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点，在多种肿瘤疾病的早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于片段长度分析的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA、标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，以所选序列或以所选段序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端下游的一段序列的互补序列作为反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T7启动子序列作为T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，加入对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶，用步骤2所设计并合成的PCR引物，对亚硫酸盐处理过的待测DNA样品进行PCR扩增；并用已知的标准的非甲基化DNA和甲基化DNA作为对照分别进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤4，以步骤3所得的PCR产物为模板，加入Taq DNA聚合酶，用T3尾引物和荧光标记的T7尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，使用DNA序列分析仪进行PCR产物的片段长度测定分析，并与标准DNA样品结果对照；如果检测到PCR扩增产物的DNA片段与标准DNA样品一致，则存在甲基化DNA；如果未检测到与标准甲基化DNA的PCR扩增产物一致的特定DNA片段，则表明样品中不存在甲基化DNA。