[发明专利]建立可控突变率突变库的方法与应用

摘要

本发明涉及“建立可控突变率突变库的方法与应用”，属于生物技术领域。本发明依据TaqDNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性，针对预期替换不同碱基数目，确认其循环数和起始模板量，建立了一种突变率可控的突变文库。因此可以根据客户的需求来定制不同碱基突变数目的文库，使突变文库的适应性和目的性增强。本发明采用CrylIe蛋白建立的突变文库中，活性显著提高的突变株占整个突变库的11.96％，其中文库III高毒力突变株的比例达到13.16％，表明该随机突变文库的方法筛选到活力显著提高的突变株的几率很高；针对高毒力突变株突变位点人工合成的突变体，杀虫活性是未突变CrylIe蛋白的1000倍。

主权项

建立可控突变率突变库的方法，步骤如下：A、确定突变条件：(1)确定替换率：将起始模板进行梯度稀释，实时荧光定量PCR扩增，最低浓度的指数扩增最大循环数下可以得到最多的突变体；挑取最低浓度下的若干克隆测序，得到每个克隆平均突变碱基数，按式(I)计算替换率，替换率＝每个克隆平均突变碱基数/(突变目的片段碱基数×最大循环数)；(I)(2)确定预替换碱基数目所需的指数扩增循环数C1、C2、C3......，按式(II)计算：循环数＝预期替换碱基数目/(突变目的片段碱基数×替换率)(II)其中C1、C2、C3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时所需指数扩增循环数，(3)确定所需起始模板量：实时荧光定量PCR扩增处于指数扩增的最大循环数与步骤(2)中确定的循环数C1、C2、C3......相比较，最接近的该PCR扩增所用模板量确定为所需起始模板量T1、T2、T3......其中T1、T2、T3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时PCT扩增所需起始模板量，B、可控突变率突变库的建立：按照确定的循环数C1、C2、C3......和对应确定的起始模板量T1、T2、T3......，将起始模板PCR扩增得到可控突变率突变库L1、L2、L3......，所述L1、L2、L3分别代表平均替换碱基数为1、2、3的突变库。