[发明专利]一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，步骤包括(1)构建重组表达质粒pPIC9K-LIGHT-Fc；(2)表达人LIGHT-Fc融合蛋白酵母工程菌的制备及筛选；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定。本发明弥补了传统人LIGHT制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人LIGHT蛋白的生产，则具有操作简单，原料生物体生长周期短，生产规模大(可以高密度发酵)，提取成本低，产物活性高等优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

主权项

一种人LIGHT‑Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)重组质粒pPIC9K‑LIGHT‑Fc的构建①人LIGHT胞外段cDNA的PCR扩增根据GenBank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物：Primer 1：5′‑CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG‑3′，划线部分为EcoR I酶切位点，178‑197Primer 2：5′‑CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT‑3′，划线部分为BamH I酶切位点，701‑720以pET32a‑LIGHT重组质粒为模板，进行PCR反应扩增人LIGHT胞外段基因；②将含Fc片段的重组质粒pKS‑IL‑15‑Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收含pKS载体和Fc的大片段，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16℃过夜连接，经转化和酶切鉴定后得到pKS‑LIGHT‑Fc重组质粒；③EcoR I和Not I双酶切pKS‑LIGHT‑Fc重组质粒回收LIGHT‑Fc融合基因，与用相同限制性内切酶双酶切的pPIC9K质粒于16℃过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质粒命名为：pPIC9K‑LIGHT‑Fc；(2)人LIGHT‑Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定①将构建的重组质粒pPIC9K‑LIGHT‑Fc用Sal I酶切线性化，同时将空载体pPIC9K相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；电转化GS115感受态细胞，涂布MD平板，所得的his+转化子又涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得高G418抗性的阳性克隆；②提取多拷贝转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aox1基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，仅出现一1726bp条带者为甲醇利用慢型，即Muts型，出现上述条带及一2.2Kb条带者为甲醇利用快型，即Mut+型；(3)人LIGHT‑Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达①在毕赤酵母中诱导表达LIGHT‑Fc融合蛋白将筛选出的重组子接种5ml YPD试管，30℃，250rpm振荡培养16‑18h，再以1％接种量接种至20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD600＝2‑6，离心收集菌体。若为Mut+型转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为Muts型转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基重悬；30℃，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇至0.5％，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取1mL培养基分析表达水平，以确定最佳收菌时间；②LIGHT‑Fc融合蛋白的鉴定A)抽提诱导后酵母菌体的总RNA，以Primer 1、Primer 2为引物进行RT‑PCR反应；B)重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS‑PAGE电泳；C)以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人LIGHT‑Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。