[发明专利]一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法

摘要

本发明公开了一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法，旨在提供一种能够消除未吞噬荧光酵母细胞对分析结果的影响，对吞噬细胞吞噬酵母的个数进行定量分析，快速、准确、简单易行的检测吞噬细胞活性的方法。包括下述步骤：制备啤酒酵母细胞冻干粉；利用FITC标记啤酒酵母细胞；将荧光标记啤酒酵母细胞的悬液与小鼠血清室温孵育；将腹腔吞噬细胞悬液加入培养板的一个孔中；将与小鼠血清孵育后的荧光标记啤酒酵母细胞的悬液与同样的腹腔吞噬细胞悬液加入到细胞培养板中其余的孔中，将细胞培养板贴壁孵育；利用流式细胞仪获取数据并对数据进行分析。本发明方法较为准确的测定了吞噬率和吞噬指数，重复性好。

主权项

一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)制备啤酒酵母细胞冻干粉：利用土豆培养基培养啤酒酵母细胞，并将获得的啤酒酵母细胞溶液通过冷冻干燥制成啤酒酵母细胞冻干粉；(2)利用FITC标记啤酒酵母细胞：将FITC与二甲亚砜按照1mg∶200μl的比例溶解，然后与pH值为9.5、浓度为0.5M的碳酸缓冲液混合配制成浓度为0.1mg/ml的FITC溶液备用；将步骤(1)中得到的啤酒酵母细胞冻干粉与pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液按20mg∶1ml的比例混匀后，80℃灭活15min；灭活后离心，弃上清液取沉淀；将得到的沉淀物与上述备用的0.1mg/ml的FITC溶液混匀，室温避光孵育1h对啤酒酵母细胞进行荧光标记，其中，0.1mg/ml的FITC溶液的用量为与步骤(1)中得到的啤酒酵母冻干粉的比例为1ml∶20mg；将上述荧光标记后的溶液用pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液离心洗涤，直至上清液无色透亮；离心，弃上清液取沉淀得到荧光标记的啤酒酵母细胞；检测荧光标记率，调整最终荧光标记率合格的荧光标记啤酒酵母细胞悬液，其荧光标记啤酒酵母细胞浓度为2×109个/ml于4℃冰箱中保存备用；(3)将步骤(2)中得到的备用的荧光标记啤酒酵母细胞的悬液与小鼠血清按照体积比为1∶1的比例室温孵育60min，用pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液调整荧光标记啤酒酵母细胞浓度为1×109个/ml；(4)将吞噬细胞的个数至少为1×106个/ml的腹腔吞噬细胞悬液加入培养板的一个孔中作为阴性对照；将步骤(3)中得到的与小鼠血清孵育后的荧光标记啤酒酵母细胞的悬液与同样的上述吞噬细胞的个数至少为1×106个/ml的腹腔吞噬细胞悬液加入到细胞培养板中其余的孔中，按照吞噬细胞和荧光标记的啤酒酵母细胞个数比为1∶20的比例混合；然后将细胞培养板置于37℃培养箱中贴壁孵育40min，用4℃pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液冲洗除去细胞培养板中多余的啤酒酵母细胞和没有贴壁的腹腔吞噬细胞，最后，在培养板除阴性对照孔外的各孔中加入4℃的0.5mlpH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液混匀，获得吞噬荧光啤酒酵母细胞的腹腔吞噬细胞悬液，用移液枪将其转移至流式管中，将流式管置于冰上，待上流式细胞仪检测；(5)利用流式细胞仪对步骤(2)中备用的荧光标记啤酒酵母细胞悬液和步骤(4)中得到的吞噬荧光啤酒酵母细胞的腹腔吞噬细胞悬液样本进行检测，获取数据并对数据进行分析：①取步骤(4)中没有加荧光啤酒酵母细胞的腹腔吞噬细胞悬液作为阴性对照进行上样，通过调整FL1荧光通道电压，使腹腔吞噬细胞群体峰的位置位于荧光电压横轴左侧，并对腹腔吞噬细胞进行获取；②在流式细胞仪各荧光电压参数和阈值保持不变的情况下，利用流式细胞仪测得步骤(2)中备用的荧光标记的啤酒酵母细胞的平均荧光强度，并以此荧光强度作为标准；③取步骤(4)中获得的吞噬荧光啤酒酵母细胞的腹腔吞噬细胞悬液进行上样，在流式细胞仪各参数保持不变的情况下，利用流式细胞仪对流式管中的腹腔吞噬细胞样本进行细胞获取；④利用BD CellQuest Pro数据分析软件对获取的腹腔吞噬细胞数据进行分析，先画散点图，通过前向光和侧向光，圈住腹腔吞噬细胞群体区域，然后画柱状图对阴性区域设门M1；将步骤②的荧光标记的啤酒酵母细胞的平均荧光强度设为一个标准单位，对步骤③得到的细胞获取结果按照标准单位的倍数进行设门，从门M1的右端至一个标准单位的位置为M2，在2倍、3倍......、n-1倍标准单位处设门依次分别为M3、M4......Mn，其中：M1代表M1门内的腹腔吞噬细胞数，即阴性腹腔吞噬细胞群体，为没有吞噬啤酒酵母细胞的腹腔吞噬细胞总数；M2代表M2门内的腹腔吞噬细胞总数，即吞噬1个酵母细胞的腹腔吞噬细胞个数；Mn代表Mn门内的腹腔吞噬细胞个数，即吞噬n-1个酵母细胞的腹腔吞噬细胞个数；根据设门的个数来确定n的值，对门内细胞进行分析，分别得到M1、M2、M3......Mn门内的腹腔吞噬细胞个数和M1门内腹腔吞噬细胞占总吞噬细胞的百分率，按照下列两个公式分别计算吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数：吞噬率(％)＝吞噬啤酒酵母细胞的吞噬细胞数/获取的吞噬细胞总数＝1-M1门内吞噬细胞占总吞噬细胞的百分率；吞噬指数＝被吞噬的酵母细胞总数/获取的吞噬细胞总数＝[M2+2M3+3M4+......+(n-1)Mn]/获取的吞噬细胞总数。