[发明专利]小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用

摘要

本发明涉及一种小鼠单抗蛋白的制备，特别涉及一种小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用；制备在免疫体系处于激发态下制备小鼠IL-15亚型蛋白，通过体外实验检测其对正常小鼠IL-15蛋白的拮抗作用，提供该亚型蛋白在自身免疫性疾病等临床治疗中的应用；本研究证明，未经LPS刺激的脾细胞检测不到该种亚型，而在LPS刺激后的原代培养或细胞株来源的巨噬细胞及B细胞中均可检测到该亚型，提示该亚型有可能在免疫系统激活的条件下发挥着重要的负反馈调控功能；本发明首次在免疫系统激活状态下发现了该亚型蛋白，并做了其功能的相关研究，从而为其在机体免疫调控中发挥的作用提供了更为直接的证据。

主权项

一种小鼠IL-15亚型融合蛋白的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)扩增小鼠IL-15亚型基因片段：取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用0.1μg/ml-100μg/m LPS作用24h-48h刺激小鼠脾细胞，获得刺激后的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，通过Trizol-氯仿法抽提总RNA；根据NCBI所公布小鼠IL-15 cDNA序列NM008357.1及pET43.1原核表达载体的结构设计特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2，经逆转录-PCR操作扩增获得小鼠IL-15目的片段；(2)获取小鼠IL-15亚型基因克隆：取步骤1所得PCR产物，按照凝胶回收试剂盒说明回收IL-15基因亚型片段；将回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其基因序列Seq NO.3；(3)构建重组小鼠IL-15的pET43.1原核表达载体：取测序鉴定正确的步骤2所得质粒及原核表达载体pET43.1，分别进行SacI、XhoI内切酶双酶切并按照凝胶回收试剂盒说明书回收酶切所得片段；将回收所得酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定；(4)pET43.1-IL-15亚型基因转化菌的表达：取鉴定正确的步骤3中重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落，抽提质粒，酶切鉴定，筛选正确转化的表达菌pET43.1-IL-15/BL21；(5)纯化并获得无标签的小鼠IL-15亚型蛋白Seq NO.4。