[发明专利]人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法

摘要

本发明公开的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法，包括：采集脂肪；获取和分离人脂肪成体干细胞；培养人脂肪成体干细胞；检测、冻存人脂肪成体干细胞；建库。利用本发明的获取人脂肪成体干细胞的方法，可有效的分离、纯化、扩增脂肪成体干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立长期存储人脂肪干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量干细胞资源。根据获取的人脂肪成体干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，该库为健康成人储存脂肪干细胞，为其本人在罹患需要采用干细胞移植时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于干细胞制剂的生产。

主权项

一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，包括：(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1‑2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50‑70分钟，再置于离心机中以1600‑2000转/分钟的转速离心4‑10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1‑2×104/cm2接种于培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4‑5天后更换新的含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3‑4天更换含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶‑EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用10mL的D‑Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入1mL胰酶‑EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存，将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1‑2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到‑80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。