[发明专利]豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法

摘要

本发明涉及生物制氢技术，一种豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法。现有莱茵衣藻制氢的缺点是：莱茵衣藻氢酶对氧气敏感，容易受氧气的抑制而失去活性；限制了衣藻的产氢效果。本发明公开了一种豆血红蛋白亚铁螯合酶基因和球蛋白亚基基因在莱茵衣藻产氢中的应用，将豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和球蛋白亚基基因lba构建在莱茵衣藻叶绿体表达载体中，并将该表达载体转入莱茵衣藻叶绿体中，使hemH-lba基因在莱茵衣藻叶绿体中表达。本发明的优点是：转化的莱茵衣藻的密闭培养体系中氧气含量下降地明显比未转基因莱茵衣藻快，并且氧气含量能维持较低水平，产氢量明显增加。

主权项

1.豆血红蛋白亚铁螯合酶基因提高莱茵衣藻制氢产量的方法，步骤如下：(1)莱茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培养：A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种：(a)莱茵衣藻正常培养条件：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m^-2s^-1)；50～100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、莱茵衣藻产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m^-2s^-1)，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；D、慢生大豆根瘤菌培养条件：用pH 7.2的酵母提取液-甘露醇液体培养基，温度28±1℃、黑暗条件下200rpm转速震荡培养，至对数生长期，吸光度OD₆₀₀值达到0.6-0.8，1％接种继代；E、用气相色谱仪测定氢气和氧气含量：分子筛5×1/8(OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；(2)豆血红蛋白hemH基因和lba基因的克隆：A、取序列号M92427慢生大豆根瘤菌hemH基因和序列号V00453大豆lba基因；B、分别提取慢生大豆根瘤菌的总DNA，提取大豆的总RNA，再对大豆总RNA进行浓度和纯度检测，反转录成cDNA；C、分别克隆hemH基因和lba基因；反应条件为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1.5min；共30个循环；72℃延伸15min；反应产物纯化回收；C、测序鉴定hemH基因、lba基因的特异性引物：hemH基因的特异性引物为：hemH-P1：5’-atgtcgaccgccgctc-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；hemH-P2：5’-tatatccagccctggagctcgcg-3’，斜体表示SacII酶切位点序列；lba基因的特异性引物为：Lba-P1：5’-caaa ttt aaa ttt atg gtt gct ttc actgag-3’，斜体表示SmalI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；Lba-P2：5’-tccata cta att atg cct tct taa tag c-3’，斜体表示SacI酶切位点序列；(3)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：A、用限制性内切酶SmalI和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和载体cg40，将纯化的lba基因片段通过上述酶切位点用T4 DNA连接酶连接质粒cg40中的aadA基因，形成aadA-lba融合基因，得到载体cg401-1-lba；用SacII酶切位点将hemH基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemH-lba；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃下3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m^-2·s^-1)和25±1℃条件下培养24小时；用基因抢轰击转化；真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-hemH-lba DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，在25±1℃和100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m^-2·s^-1)的连续光照条件下，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；(5)分析转基因莱茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表达：A、hemH-lba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：a、hemH基因和lba基因通过同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA上，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为8229bp；未整合的PCR产物是5400bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P1：5’-aga cag cca aca ttt tgtta-3’；cpDNA-P2：5’-gct tca aaa aca aaa tca aa-3’；b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl NET重悬沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％SDS，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl 5mol/L KAc，静置离心；上清中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl TE缓冲液，用于PCR检测；B、转基因莱茵衣藻中hemH基因和lba基因转录的检测：取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemH基因和lba基因的特异性引物和克隆hemH基因和lba基因所述的PCR条件扩增，进行hemH基因和lba基因转录水平的检测；C、转基因莱茵衣藻中亚铁螯合酶和Lba表达量的检测：a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液：50mM Tris/HCl pH 8.3plus 1％Triton-X 100；上样缓冲液：0.25M Tris-HCl，pH 8.0；25％ glycerol；7.5％SDS；0.25mg ml-1 bromophenolblue；12.5％(v/v)2-mercaptoethanol；b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，快速室温3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转PVDF膜；分别用抗豆血红蛋白亚铁螯合酶多克隆抗体和抗大豆Lba多克隆抗体做性免疫杂交检测，对HRP标记的抗体进行化学发光检测；(6)分析重组豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻生长的影响：A、用TU-1901双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃下12000rpm离心10min；取上清，测定OD₆₆₅及OD₆₄₉的吸光值；C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L：叶绿素Chl(mg/l)＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅；(7)分析豆血红蛋白hemH-lba基因对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：A、缺硫培养基中耗氧量和产氢量的检测：B、含硫培养基中耗氧量和产氢量的检测。