[发明专利]磁性纳米固定化酶催化生产大豆异黄酮苷元的方法

摘要

本发明涉及磁性纳米固定化酶催化生产大豆异黄酮苷元的方法。本发明方法包括以下操作步骤：(1)糖苷型大豆异黄酮原料的超临界流体萃取富集；(2)大豆异黄酮糖苷水解酶的提取；(3)磁性纳米固定化酶的制备；(4)糖苷型大豆异黄酮原料的磁性纳米固定化酶催化转化；(5)大豆异黄酮苷元的提取。用本发明的制备方法，超临界萃取工艺简单易操作，操作过程二氧化碳无毒、无残留，糖苷萃取率高；磁性纳米固定化酶制备方法简单，可以通过外部磁场将酶简捷的回收、反复使用；制备的产品大豆异黄酮苷元结构和生理活性不受破坏，含量高。本发明方法生产的大豆异黄酮苷元产品中大豆异黄酮苷元浓度之和为82.7％，金雀异黄素含量为90.3％。

主权项

1、磁性纳米固定化酶催化生产大豆异黄酮苷元的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)、糖苷型大豆异黄酮原料的超临界流体萃取富集：取用夹带剂充分润湿的糖苷型大豆异黄酮原料，在夹带剂、萃取压力20-40Mpa、萃取温度30-50℃的条件下超临界二氧化碳流体萃取2-4h后，从分离釜中放出萃取物；去除萃取物中的夹带剂，获得糖苷型大豆异黄酮原料；(2)、大豆异黄酮糖苷水解酶的提取：在由麦麸2. 0g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁0.01g/L组成的培养基上接种黑曲霉，接种量15％，装液量70mL/100mL三角瓶；在摇瓶转速200±5r/min、温度为30±0.5℃条件下发酵3天；将发酵液于10000r/min，4℃条件下离心10min，取上清液为β-葡萄糖苷酶粗酶液；用30％～80％饱和度的硫酸铵沉淀β-葡萄糖苷酶粗酶液；将沉淀物溶于0.1mol/L、pH5.0的乙酸缓冲液于温度4℃下离心脱盐、浓缩；浓缩液上离子交换树脂DEAE-52树脂分离柱，用0.2mol/L、pH6.8的磷酸缓冲液洗脱树脂分离柱，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液A，收集液A经截留分子量为500-1000道尔顿的超滤膜系统离心浓缩后，进行葡聚糖凝胶柱层析，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液B；收集液B经截留分子量为500-1000道尔顿的超滤膜系统离心浓缩，获得β-葡萄糖苷酶溶液；用0.1mol/L、pH5.0的乙酸缓冲液调节β-葡萄糖苷酶溶液，得到酶活力为1500-2000U/mL的大豆异黄酮糖苷水解酶溶液即黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液；(3)、磁性纳米固定化酶的制备：取0. 5-1.0g磁性纳米粒子加到4.5ml的pH4.0-6.0醋酸缓冲液中，然后加入体积分数为2％v/v戊二醛溶液0.5ml，中低频超声分散；再按照0.5-10mL/0.5-1.0g磁性纳米粒子的比例加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液，放置水浴恒温震荡器中，温度20-30℃、转速100-150r/min条件下固定化2-4h，利用永久磁铁收集固定化酶粒子；固定化酶粒子用pH4.0-6.0醋酸缓冲液清洗，直至流出液无蛋白检出，获得磁性纳米固定化酶；(4)、糖苷型大豆异黄酮原料的磁性纳米固定化酶催化转化：将糖苷型大豆异黄酮原料用pH4.5醋酸缓冲液配制成0.5-1.0mg/mL的溶液，并用1.0mol//L的盐酸调节所述溶液的pH至4.9-5.1，得到大豆异黄酮糖苷溶液；将上述步骤3)中所得的磁性纳米固定化酶按照0.8-1.2g/0.8-1.2mL的比例加入pH5.0醋酸缓冲液中，充分搅拌使其悬浮均匀，形成磁性纳米固定化酶悬浮液；向所述大豆异黄酮糖苷溶液中加入磁性纳米固定化酶悬浮液形成混合液，加入的磁性纳米固定化酶悬浮液体积为所述大豆异黄酮糖苷溶液体积的0.5～1倍；将所述混合液在温度20-50℃条件反应20min-60min，获得高大豆异黄酮苷元含量的转化液；(5)、大豆异黄酮苷元的提取：离心或外加磁场分离高大豆异黄酮苷元含量的转化液中的磁性纳米固定化酶，获得大豆异黄酮苷元溶液；大豆异黄酮苷元溶液减压浓缩得到高纯度大豆异黄酮苷元成品。