[发明专利]猪颗粒型冻精的制备及解冻方法

摘要

一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法，方法的步骤为：猪精液的采集和常规检查、稀释液的配制、精液的稀释与平衡、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻。本发明还涉及所述稀释液及解冻液的配制。与已有的技术相比，本发明的优点在于：鲜精经水浴平衡后直接离心，不用加入其它稀释液，减少操作步骤，降低成本；冻精的颗粒剂型操作简单，取用方便；解冻液配方简单，易得，能起到精液解冻和解冻后保存的作用，精液解冻后的存活时间不低于420min。

主权项

1.一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法，方法包括一下步骤：1)、猪精液的采集和常规检查：将采得猪精液于30分钟内带回实验室，镜检活率为0.7以上者，可用于冷冻保存；2)、稀释液的配制：由葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、蔗糖0.5～4.0g、SDS0.1～0.5g、咖啡因0.0097～0.1554g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸馏水100ml配制成基础液，取80ml所述基础液加入20ml卵黄构成稀释液I液，在100mlI液中加入3ml的甘油为稀释液II液，所有液体配好后保存在0～4℃备用；3)、精液的稀释与平衡：将经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35℃水浴中预孵育30～60分钟后，以1000转/分离心10分钟，弃上清液，按1∶1体积比加入稀释液I液，混匀，使重悬浮的精子密度达(4～7)×109个/ml；用8层纱布将稀释精液包裹好并放入4℃冰箱平衡2h；平衡结束后，再以1∶1加入稀释液II液(基础液+20％卵黄+3％甘油)，充分混匀，再于4℃冰箱继续平衡2h；4)、精液的冷冻和保存：平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有凹窝的氟板放入盒内，距液氮面2～3cm，调节氟板温度为-130℃～-120℃，每个凹窝滴入0.1ml精液，迅速滴冻，氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5～8min后，将氟板连同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋放入液氮内预冷，然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中，冻精颗粒的收集过程必须在液氮中进行；冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上标签，记录好精液的相关信息，然后移入液氮罐长期保存；5)、冷冻精液的解冻：A、解冻液的配置：葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.5g、安钠咖(10％)5ml、青霉素80000IU、链霉素100000IU及蒸馏水100ml；B、解冻方法：将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留20s后迅速放入42℃水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的充分混合。解冻液的添加量为1ml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。