[发明专利]一种能够自发消除农残的果实种质培育方法

摘要

一种能自发消除农残的果实种质的培育方法，包括下列步骤：(1)按常规方法克隆果实特异性启动子：(2)人工合成有机磷水解酶OPH的基因；(3)构建果实特异性OPH植物表达载体：将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI双酶切pGEM-TE8和pSH，把E8构建到pSE8；用EcoRI单酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH构建到pSE8OP，筛选出正向连接载体，从而得到果实特异性启动子驱动的植物表达载体备用；(4)转化土壤农杆菌和植物外植体；(5)转基因植株的分化、移栽。本发明既能降低果实的农药残留，同时也不影响田间农药的功效，从而有利于提高产量和质量。

主权项

1、一种能自发消除农残的果实种质的培育方法，包括下列步骤：(1)按常规方法克隆果实特异性启动子：所述的果实特异性启动子是E8等果实特异性基因表达启动子；根据Genbank accession：AF515784.1中提供的E8启动子序列的特点，设计引物以番茄DNA为模板做PCR扩增，E8启动子的引物为：P1：5’-CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG-3’；P2：5’-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG-3’；(2)人工合成有机磷水解酶OPH的基因：所述的有机磷水解酶具有Genebank Accession：AAA24930所述氨基酸序列，根据番茄密码子偏好性翻译成碱基序列后人工合成而得；(3)构建果实特异性OPH植物表达载体：将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI双酶切pGEM-TE8和pSH，把E8构建到pSE8；用EcoRI单酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH构建到pSE8OP，筛选出正向连接载体，从而得到果实特异性启动子驱动的植物表达载体备用；(4)转化土壤农杆菌和植物外植体将表达载体pSE8OP用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，挑取含有表达载体pSE8OP的农杆菌单菌落，在含100mg·L-1Km和20mg·L-1Rif的YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5-0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体；挑选鲜嫩的植物外植体于重悬的菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后接于共培养基上，2天后转入脱菌培养基(含Cef 300mg·L-1)上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；(5)转基因植株的分化、移栽将在脱菌培养基上存活下来的外植体接于分化培养基上，分化的幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5-10cm时打开瓶盖，炼苗3-5d后移植到土壤中。