[发明专利]在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法 首先，建立发芽种子真空侵染法并进行优化，选择根长2-3厘米的豌豆种子为侵染材料，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因对真空时间、真空压力及菌液浓度进行优化得到表达外源蛋白的最适条件。然后进行人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建，将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列连入改造的植物病毒表达载体，转入农杆菌GV3101中用于在植物中瞬时表达。在最佳条件下侵染豌豆发芽种子，侵染后12-14天收获外源蛋白。本发明周期短、易操作、成本低、无污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白。

主权项

1、在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法，其特征是：1). 以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系首先将豌豆早褐病毒载体pCAPE1和pCAPE2-GFP转入农杆菌GV3101中，挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子；侵染后将种子播种于土壤中，8-20天在紫外灯下观察豌豆植株中绿色荧光蛋白的表达情况以确定侵染条件，选择适当的真空压力、真空时间、菌液浓度和伤害处理四个因子进行体系的优化，在无伤害处理条件下，重悬液浓度OD600＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，于侵染后12-14天收获外源蛋白；