[发明专利]在同一标本上检测同一抗原表达的方法

摘要

本发明公开了一种在同一标本上检测同一抗原表达的方法，荧光量子点标记链霉亲和素复合物可以直接与生物素化二抗结合，而生物素化二抗也能与免疫酶技术中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合，这样能把免疫荧光和免疫酶两种技术完美地结合起来，从而能在同一标本上检测同一抗原的表达。该方法可用于检测检测人体和动物的新鲜组织、石蜡包埋组织和不同细胞系内的抗原表达情况，灵敏度更高，结果更有说服力，实验成本低，实验条件不苛刻，整个实验过程均不需要避光，在一般免疫组化室均可完成，适合于广泛推广应用。

主权项

1、一种在同一标本上检测同一抗原表达的方法，其步骤是：(1)首先是石蜡包埋组织脱蜡、水化、TBS为0.01M pH7.4TBS溶液：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水调至1000ml，浓盐酸调pH值为7.4，冲洗2～4次，每次3min；其次是新鲜组织直接从第3步开始；第三是培养细胞固定后，加入TBS冲洗2～4次，每次3min，然后加入通透液：0.1％Triton-X100，室温孵育5-10min，最后TBS冲洗2～4次，每次3min，进行第(3)步；(2)0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液，A液：0.1M/L柠檬酸：柠檬酸21.0g，加蒸馏水调至1000ml，浓盐酸调pH值为6.0；B液：0.1M/L柠檬酸钠液，柠檬酸钠29.41g，加蒸馏水调至1000ml，使用时，取A液1.9ml，B液8.1ml，加蒸馏水90ml，微波或高压进行抗原修复，冷却至室温，TBS冲洗2～4次，每次3min；(3)滴加2％BSA牛血清白蛋白封闭缓冲液，2g BSA溶于100ml TBS溶液中，37℃湿盒孵育30～35min；(4)滴加待检测的一抗，37℃湿盒孵育1～2小时或4℃冰箱过夜，TBS-T，即在TBS溶液里加入Tween 20，使后者的终浓度为0.05％，漂洗3min/次×(2～4)次；(5)滴加2％BSA封闭缓冲液37℃湿盒孵育10～15min；(6)滴加生物素化羊抗兔或羊抗鼠IgG，37℃湿盒孵育30min，TBS-T漂洗3min/次×(2～4)次；(7)滴加2％BSA封闭缓冲液37℃湿盒孵育10～15min；(8)滴加用2％BSA封闭缓冲液稀释的量子点标记的链霉亲和素复合物，工作浓度：1∶50～200，37℃湿盒孵育30～60min，TBS-T漂洗3min/次×(2～4)次；(9)滴加50％甘油封片，上荧光显微镜用不同波长激发量子点，以细胞内出现橙红色的荧光颗粒为阳性；(10)标本自发荧光对照：标本只加TBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内有荧光，为自发荧光，阳性对照：用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光；(11)2-8℃保存，2-4周后发现荧光信号减弱，待检标本置于TBS中浸泡5～15min，直至盖玻片自然脱落；(12)重复步骤(7)、(8)、(9)各一次，重新恢复抗原的荧光信号；(13)在步骤(11)之后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃湿盒孵育15～20min，TBS漂洗3min/次×(2～4)次；(14)DAB显色，观察结果，观察到待检抗原的定位与免疫荧光法一致。