[发明专利]一种果蝇抗菌肽伏蝇素的制备方法

摘要

本发明涉及一种果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin的制备方法。该方法的具体步骤为：果蝇伏蝇素Diptericin基因的获得，重组质粒pGEX－4T－1－diptericin的构建以及融合蛋白的表达纯化和伏蝇素Diptericin的获得。本发明方法采用基因工程方法生产果蝇伏蝇素Diptericin，比化学合成法成本低。以大肠杆菌为表达宿主，表达量较高，达到了315.4mg/L。以pGEX－4T－1为表达载体，易于融合蛋白的纯化，只需经一次亲和层析便可得到纯度较高的融合蛋白。只需经一次酶切便可得到纯的伏蝇素Diptericin，纯化简便。

主权项

1.一种果蝇抗菌肽伏蝇素的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：a.获得果蝇伏蝇素Diptericin基因：提取果蝇总RNA，然后以果蝇总RNA为模板，根据果蝇diptericin基因序列设计特异性引物：上游引物D1：5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；下游引物D2：5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；然后进行PCR扩增得到280bp的diptericin片段；b.重组质粒pGEX-4T-1-diptericin的构建：将用EcoR I和Xho I双酶切后的diptericin片断插入质粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之间，构成重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin；转化大肠杆菌BL21，挑选出抗Ampicillin的阳性克隆；抽提质粒，用EcoR I和Xho I双酶切，得到280bp左右的片段，即为重组质粒pGEX-4T-1-diptericin；c.融合蛋白的表达纯化和伏蝇素Diptericin的获得：将上述的重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液体培养基中培养至OD600值达到0.6，加入100mM IPTG储液至终浓度为1.0mM；继续培养4小时后离心，收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集果蝇伏蝇素Diptericin的融合蛋白组分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反应16小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集流出组分，冷冻干燥，得到果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin。