[发明专利]一种抑制小鼠B7－DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种抑制小鼠B7－DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其构建流程是：根据Genebank提供的小鼠B7－DC的基因序列，选取编码区第361～379位核苷酸序列为靶序列设计并合成引物，通过引物退火，连接至干扰载体pAS，即得本发明构建的真核表达载体shRNA－B7－DC。本发明所构建的真核表达载体，不仅能特异性靶向并抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞中B7－DC基因的表达，还可以大量扩增，并可将其有效片段克隆至其它更好的载体上，具有操作简单、应用方便、毒副作用小、成本低等优点，可以为研究B7－DC基因的功能、增强树突状细胞诱导的免疫应答中的应用研究提供一个有效工具。

主权项

1.一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：A)根据Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，从编码区中选取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG为靶序列，设计并合成引物，引物为：siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；B)将载体pAS经BgI II、Hind III双酶切，用回收试剂盒回收；C)siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火，即：用三蒸水稀释引物至10μmol/μl，取siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2各1μl，加TE补至20μl，95℃5分钟，70℃10分钟，10℃20分钟；D)取5μl siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火产物，加入1μl pAS经BgI II、Hind III双酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl10×连接缓冲液，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜；E)将步骤D)所得的连接产物转化至大肠杆菌DH5α，即：取连接产物20μl，加入200μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，再冰浴2分钟，加入800μlLB液体培养基，37℃、225rpm振摇60分钟，取200μl菌液均匀涂在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜；F)挑取单个克隆菌落，置于3ml含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基上，37℃培养过夜；G)提取步骤F)获得的菌液的质粒DNA；H)所提质粒DNA经EcoR I和Hind III酶切鉴定，选出正确质粒，命名为shRNA1-B7-DC；I)按照步骤A)至步骤H)的操作构建质粒shRNA2-B7-DC。