[发明专利]定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，包括：样本的收集与处理，DNA提取，引物设计和合成，第一体系和第二体系的PCR扩增反应，PCR产物的检测，第三体系的PCR扩增反应，PCR产物的检测。本发明还提供了一种准确、可靠的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒。本发明结合了定量荧光PCR灵敏、精确的特点与短串联重复序列分布广、均匀、多态性、杂合度高的特点，可应用在外周血及羊水、脐带血、绒毛等产前样本的常见染色体病数目的检测上。

主权项

1、一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.样本的收集与处理：样本为外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；B.DNA提取：按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD280及OD260值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD260/OD280的值为1.6～1.8；C.引物设计和合成：选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记；D.第一体系和第二体系的PCR扩增反应：进行两个反应体系的PCR扩增反应，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。PCR扩增体系如下：DNA模板 2～40ng引 物 2～20pmol热启动TaqDNA聚合酶 2U10×PCR缓冲液 2.5μlMgCl2 1.5mmol/LdNTP 200μmol/L加水至总体积 25μlPCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；E.PCR产物的检测：将PCR产物按现有遗传分析仪的操作说明进行处理，根据扩增产物片段大小及荧光素的不同进行区分，通过样本DNA扩增产物的STR形式的定量分析，参照业内制订的分子遗传学检测标准，判断被检者的染色体的数目是正常的二体，还是异常的三体，或是暂不能判定其染色体数目的情况；F.第三体系的PCR扩增反应：对于步骤E中未能达到上述检测标准的样本，再进行第三体系的PCR扩增反应，第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317；PCR扩增体系和PCR扩增条件均与步骤D相同；G.PCR产物的检测：与步骤E相同。