[发明专利]一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法

摘要

本发明涉及一种梨花粉管中分离和纯化线粒体的方法，属于生物技术领域。包括花粉的采集、培养，线粒体提取液的配制、清洗液的配制、Percoll梯度的配制以及花粉管线粒体分离过程，将培养好的花粉管用细胞筛过滤，添加线粒体提取液研磨，获得细胞质液体，振荡离心后，用Percoll梯度液纯化、清洗获得线粒体。采用本方法获得完整的具有活力的花粉管的线粒体，提高了线粒体分离纯化效率。这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，适合于作为花粉管的生理生化及细胞遗传等实验材料。对于研究开发花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。

主权项

1、一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法，包含下列步骤：1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，风干；2)花粉的培养：培养基的制备：将10％蔗糖，0.03％Ca(NO3)2·4H2O，30mMα-磺基甲脂磺酸钠，20％聚乙二醇4000，0.01％硼酸溶于蒸馏水中，用NaOH调整溶液pH值至6.0～6.5；取20mg干燥花粉，于20ml花粉于培养基中，在黑暗条件下，25℃，180rpm，培养3～3.5h，获得培养好的花粉管；3)线粒体提取液的配制：50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes，600mM山梨醇，5mM乙二胺四乙酸，0.1％牛血清蛋白，1％聚乙烯吡咯烷酮40000，1mM DTT，5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4；4)清洗液的配制：50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes，0.5M蔗糖，5mM乙二胺四乙酸，0.1％BSA牛血清蛋白，5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4；5)Percoll梯度的配制：分别取体积比45％，21％，13.5％Percoll溶于50mM pH 7.4的Hepes-KOH缓冲液中，其缓冲液中还含有0.5M蔗糖，5mM EDTA，0.1％牛血清蛋白，5mM KH2PO4；6)花粉管线粒体分离过程：a)匀浆：将步骤2)培养好的花粉管连同培养基一起，用500目/英寸细胞筛过滤，用吸水纸从细胞筛底部将培养基吸干，然后将细胞筛置于一培养皿上，往花粉管上添加线粒体提取液，以200rpm速度在细胞筛上研磨，研磨过程中不断添加线粒体提取液，使从已经破碎的花粉管流出的细胞质能及时的经细胞筛流入到培养皿中，以上操作均在0～4℃进行；b)分离：将上述培养皿得到的细胞质液体转入30ml离心管中，振荡4秒后于2000g，4℃迅速离心5min，将上清液转入另一离心管中，继续于18000g，4℃离心30min，获得沉淀，即为粗线粒体组分。c)纯化：将上述得到的沉淀悬浮于1ml清洗液中，将Percoll梯度液按45％，21％，13.5％顺序体积比1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于80000g，4℃，水平离心45min，离心后线粒体在45％和21％Percoll之间，为乳白色。d)Percoll的去除：将纯化的线粒体溶液用20倍体积的清洗液稀释后，在4℃，20000g离心45min，得纯线粒体，用少量清洗液悬浮后，备用。