[发明专利]一种双氟米松人工抗原的制备方法

摘要

一种双氟米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。本发明是以双氟米松为原料，利用丁二酸酐与双氟米松反应生成双氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备双氟米松的人工抗原即双氟米松－牛血清蛋白。本发明合成了双氟米松的人工抗原，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

主权项

1.一种双氟米松人工抗原的制备方法，其特征是以双氟米松为原料，利用丁二酸酐与双氟米松反应生成双氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备双氟米松的人工抗原即双氟米松-牛血清蛋白；步骤为：(1)人工半抗原的制备：双氟米松和丁二酸酐配料摩尔比为1∶3，称取双氟米松0.4mmol和丁二酸酐1.2mmol置于50mL圆底烧瓶中，加入2.5mL无水吡啶，在60℃下加热搅拌6h，将反应物转入10mL含10％盐酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到双氟米松半抗原，置于4℃保存；硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；(2)人工抗原的制备：制备A液：称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺，0.099mmol N，N-二环己基碳二亚胺于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；磷酸盐缓冲液：将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL混合即为pH8.0的磷酸盐缓冲液；制备B液：称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液；在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：双氟米松-牛血清蛋白。