[发明专利]联用积分法和初速度法测定酶活性的方法

摘要

一种联用积分法和初速度法测定酶活性的方法；对单一酶反应体系在低于米氏常数10倍的预设底物浓度下连续监测反应3到10分钟，当起始底物浓度高于预设底物浓度70％且初速度仍在其线性范围内时测定经典初速度，当80％记录时段内底物消耗比例高于积分法所需下限时用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定最大反应速度，再将最大反应速度计算成预设底物浓度93％时的初速度，并使经典初速度和计算初速度对酶量响应曲线斜率相同；当80％记录时段内偶联酶反应体系底物消耗比例高于积分法所需下限时用对应的数值积分速度方程，迭代拟合酶反应曲线确定初速度，否则直接测定经典初速度；优化监测反应的总时间是两种方法联用的保障。

主权项

1.一种联用积分法和初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度和较高效率获得更宽线性响应范围的方法，其特征在于按如下步骤进行：(一)、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液，单一酶的单底物反应体系初始底物浓度在待测酶米氏常数0.10到10倍之间，偶联一个工具酶的反应体系所需各种底物浓度及工具酶活性与用初速度法测定偶联酶反应体系酶活性时完全相同(即待测酶的底物浓度高于其米氏常数的10倍，偶联工具酶活性尽可能高，指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限)；(二)、将上述溶液混匀后在选定温度(25～37℃)下恒温5～10分钟；(三)、在上述溶液中加入待测酶液样品，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯(或其它可连续监测酶反应过程的分析仪器的样品室)；(四)、延迟20秒，以1～60秒间隔监测与底物或产物成比例的检测信号(如光吸收)，共记录3分钟到10分钟(偶联酶反应体系记录间隔应尽量短)；(五)、数据过滤，去掉相邻数据点中检测信号变化小于仪器检测噪声2倍的数据(即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据)，换算成底物或产物浓度随时间变化的反应曲线；(六)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的积分速度方程，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的积分速度方程；如有底物或产物抑制则在积分速度方程中包含其抑制效应；(七)、在设定条件下，如所记录反应曲线中对应的最高底物浓度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范围内数据的平均速度(即经典初速度)仍低于初速度法的线性上限时，则用初速度法确定其经典初速度表示酶活性；(八)、当反应进行到记录总时间80％时(记录总时间为6分钟则此时间约4.5分钟)，如单一酶单底物体系的底物消耗比例高于积分法所要求下限(一般约40％，初始底物浓度太低或太高时此底物消耗比例的下限更高)，则以最大反应速度及初始底物浓度(或相当的对应物理量)为参数，其余动力学参数固定为已知常数，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线确定对应的最大反应速度，此即用积分法测定单一酶体系的酶活性；当偶联一个工具酶反应体系指示底物消耗比例高于积分法所要求的下限(一般为75％，指示底物的浓度不同、工具酶的动力学参数不同时此底物消耗比例要求的下限也不同)时，则用待测酶反应初速度和偶联酶指示底物浓度为参数，用对应的数值积分速度方程(数值积分步长0.1秒，尽可能短)迭代拟合酶反应曲线，达到最好拟合的待测酶反应初速度为待测参数，此即用积分法测定偶联酶反应体系的酶活性；(九)、对单一酶反应体系，用其微分速度方程和固定为常数的其它动力学参数，将积分法所得最大反应速度换算成在所用反应体系初始底物浓度93％(随初始底物浓度变化，但波动在4％以内)底物浓度下的初速度，此即用积分法所得单一酶反应体系的计算初速度；优化最大反应速度换算成计算初速度所用的底物浓度以同时满足下列两个要求：(1)计算初速度对酶量的响应曲线斜率同低酶活性范围内经典初速度对酶量的响应曲线斜率无统计差异，(2)对初速度法能可靠测定而此积分法也能可靠测定的酶活性交叉区域内的样品，用积分法所得的计算初速度同初速度法所得的经典初速度也无统计差异。