[发明专利]利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法

摘要

本发明涉及一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，主要利用农杆菌介导植物转化机理，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)组装或混合，经脂质体包装后，采用花粉管通道技术，对植物进行转化，并利用上述的方法对植物、尤其是对棉花进行转化。本发明将农杆菌－脂质体－花粉管通道技术有机的结合起来，原生质体的转化率明显提高，质粒不仅在进行入胚囊阶段受脂质体保护，而且在进入卵细胞后，能被表达的毒蛋白包被，提高了外源DNA在细胞转化过程中的稳定性，能够精确的在T－DNA区加工切割，提高了转化效率。

主权项

1、一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，其特征是通过以下过程实现的：(1)植物增强型绿色荧光蛋白基因植物表达载体的构建；(2)virD1、virD2和virE2基因克隆、原核表达分析；原核表达载体的构建及表达分析：将virD1、virD2和virE2基因从克隆载体上切下，将其融合到分泌型原核表达载体，大肠杆菌周质蛋白phoA或外膜ompA蛋白信号引导肽核酸序列的下游，构建成分泌型原核表达载体，转化到L型细胞壁缺陷的大肠杆菌中，产物直接分泌到培养基中，进行提取纯化，用纯化的蛋白加弗氏佐剂免疫新西兰白兔，抽提血清，制备一抗并测定效价，(3)virD1、virD2和virE2基因植物瞬时表达载体的构建；植物瞬时表达载体的构建：利用农杆菌Ti质粒的序列图谱和酶切图谱，在virD1、virD2 和virE2基因编码区两侧设计特异性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位点，通过高保真PCR技术进行相应的基因扩增，将产物直接构建到带有抗卡那霉素标记基因的植物表达载体上，将带有强植物启动子-毒蛋白基因-终止子的完整的表达框切下，构建到高效克隆载体pUC18的多克隆位点上，获得不带左右边界序列的植物瞬时表达载体；(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白与报告基因经脂质体包装，对烟草原生质体转化的瞬时表达和转化整合频率研究；T-DNA蛋白复合物的体外组装：将需要转化的带有目的基因pBin-EGFP植物表达载体，加入到植物细胞提取液中，并按顺序加入提取并纯化的virD1、virD2蛋白，接着加入DNA聚合酶I，通过缺口平移产生相应的T-DNA单链，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝胶阻滞电泳分析，与此同时酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、纯化DNA，最终通过特异性引物，对相应T-DNA片段进行荧光定量扩增，评估virD1、virD2和virE2蛋白活性，研究T-DNA蛋白复合体最佳组装方式和浓度配比；脂质体包装：将T-DNA蛋白复合物或virD1、virD2和virE2基因与含有目的基因GFP质粒载体按一定比例混合，用阳离子脂质体进行包装处理，并对烟草原生质体进行转化，用荧光显微镜对转化细胞进行瞬时表达研究，同时利用抗生素，对转化烟草体细胞系进行多代筛选，再生植株并检测其整合效率，以此间接推断毒蛋白在植物体内的组装活性，在此基础上对脂质体最佳转化条件及缓冲液组成进行研究；(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物体内正常表达并具有活性的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，对棉花转化效率及遗传稳定性进行研究和评价；(6)改良花粉管通道技术体系的评价：在(4)(5)研究的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，田间对特定的棉花进行转化，后代在苗期利用抗生素及长波紫外灯进行筛选，同时进行分子验证，确定其转化频率同时对转基因后代进行连续多代系谱式的跟踪调查，研究其遗传稳定性。