[发明专利]马铃薯微型薯的高效遗传转化方法

摘要

一种马铃薯微型薯的高效遗传转化方法，它包括以下步骤：(1)马铃薯微型薯的准备、(2)菌株的活化及菌种的准备、(3)侵染和共培养、(4)转基因植株再生和(5)转基因植株的检测，建立了一个适合多种马铃薯品种的微型薯遗传转化体系，该体系以微型薯为外植体，经农杆菌侵染后通过体细胞胚胎发生途径直接分化出抗性芽，经生根诱导后获得完整再生植株，转化频率均为50％以上，达到用马铃薯微型薯为转化受体，建立一个高效及适应性广的马铃薯遗传转化体系的目的。

主权项

1. 一种利用马铃薯微型薯的高效遗传转化方法，其特征在于：(1)马铃薯微型薯的诱导取脱毒试管苗，经过炼苗后，从培养基中连根拔出，移栽于温室，经过60-80d的生长，微型薯达到2-5g重，即可收获，晾干后保存；(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的农杆菌，涂布于固体Yeast Extract Peptone培养基上，28℃下倒置暗培养，使其活化；3d后挑取单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜；取700μl该菌液接种于70ml相同的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.5-0.8；(3)侵染和共培养取收获后打破休眠的脱毒微型薯，在无菌条件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、无菌水清洗5次后，去皮切成厚度为1mm的薄片，用制备好的农杆菌菌液侵染薯块5min，然后用无菌滤纸将多余菌液吸去，接种于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培养基上，共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗；(4)转基因植株再生培养将共培养后的微型薯薯块用无菌水清洗2-3次，接种于含有玉米素、吲哚乙酸、进口头孢噻肟钠和卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行植株再生培养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；在再生培养基中经过45d的培养后，将产生的健壮绿色丛生芽切下，转移至添加头孢噻肟钠和卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行生根诱导，使其形成完整的马铃薯转基因植株，培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；(5)转基因植株的检测采用PCR、Southern杂交及生物学方法鉴别再生植株，最终获得马铃薯转基因植株。