[发明专利]制备转基因哺乳动物的PAMAM－D介导的精子载体法

摘要

一种培育转基因哺乳动物的PAMAM－D介导的精子载体法，包括以下步骤：外源基因酶切呈末端粘性的线性构型，针对不同精子确定其用量范围；在合成代数大于G5及其与外源DNA电荷比2～50∶1的范围内对PAMAM－D进行筛选，以外源DNA转染精子效率高又能保持精子活力的外源DNA用量与PAMAM－D代数和剂量为最佳组合条件，以此制取PAMAM－D/外源DNA复合物；在对洗涤后上清液IF－1监测下，充分洗涤采集的精子；采用共孵育法使复合物体外转染精子，经分选提取单一转染外源DNA的精子，或以睾丸内注射形成转染外源DNA的精子，经体外授精胚胎移植、体内人工授精及自然交配使雌性动物受孕，培育转基因动物。

主权项

1. 一种制备转基因哺乳动物的PAMAM-D介导的精子载体法，其特征在于它包括以下几个步骤：(一)外源DNA质粒酶切成末端为粘性的线性构型，针对不同精子和目的基因，确定外源DNA的用量范围；在PAMAM-D合成代数G5以上及其与外源DNA电荷比2～50∶1的范围内，以不同合成代数和剂量的PAMAM-D与外源DNA混合，形成复合物转染精子，以原位杂交法检测，将转染率高而不损伤精子活力的复合物作为最佳组合，其外源DNA的用量与PAMAM-D代数和剂量作为最佳组合条件，制备最佳组合的PAMAM-D/外源DNA复合物用于转染精子细胞；(二)将采集的精子用培养液进行充分洗涤，彻底去除精清中的IF-1，以利外源DNA与精子的结合；对洗涤后的上清液以斑点杂交法监测IF-1，以上清液IF-1达到阴性的洗涤次数作为应洗涤的次数，将取得的精子密度调整至107/ml备用。(三)制备转染外源DNA的精子，其方法有二，①体外法：用由步骤(一)所得PAMAM-D/外源DNA复合物与步骤(二)取得的去除了精清的精子共孵育，在体外制取转染外源DNA的精子；②体内法：将由步骤(一)取得的PAMAM-D/外源DNA复合物打点式注入睾丸内，在体内形成转染外源DNA的精子；(四)将由步骤(三)中经体外共孵育法处理的的精子，以荧光蛋白标记用流式细胞仪进行分选，将转染外源DNA的精子筛选并提取，以单一转染外源DNA的精子用于受精，以提高外源DNA在受精卵中的结合率；在分选前先进行洗涤并以DNaseI消化处理，以消除假阳性；(五)由步骤(三)体外共孵育并经步骤(四)筛选的转染外源DNA的精子，用人工体内授精，或经体外共孵育受精后培育受精卵进行胚胎植入，也可以用睾丸内注入由步骤(一)形成的PAMAM-D/外源DNA复合物，通过自然交配或者采集精液进行人工授精；由以上方式使雌性动物受孕，产生转基因动物。