[发明专利]HCMVPP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒

摘要

一种名称为HCMVPP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒，以巨细胞病毒－AD169病毒株pp65蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合，通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化，获得鼠抗巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过ELISA和免疫荧光实验等方法鉴定其特性；成功地建立了2株稳定分泌pp65蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A6，和4A8。制备了与以往报道不同的针对巨细胞病毒(CMV)pp65蛋白的单克隆抗体，同时建立制备红细胞快速裂解的方法，其试剂盒与其它同类试剂盒相比，更为快速，简单，方便，特异性与敏感性更高。

主权项

1. 一种名称为HCMVPP65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒其特征在于：制备了与以往报道不同的针对巨细胞病毒CMV pp65蛋白的单克隆抗体，同时建立制备红细胞快速裂解的方法，其试剂盒与其它同类试剂盒相比，更为快速，简单，方便，特异性与敏感性更高。具体制作方法为：采用的关键技术为(1)人巨细胞病毒1A6与4A8单克隆抗体制备与鉴定。(2)直接裂解红细胞技术。(1)巨细胞病毒CMV pp65蛋白的单克隆抗体制备基本过程基本过程：以巨细胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合，通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化，获得鼠抗巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过ELISA和免疫荧光实验等方法鉴定其特性；成功地建立了2株稳定分泌pp65蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A6，和4A8；通过ELISA，免疫荧光实验等方法的鉴定，抗pp65蛋白的单克隆抗体性能与pp65蛋白发生特异性反应；免疫荧光实验的结果表明，pp65蛋白的单克隆抗体性能与以巨细胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白发生特异性结合；结果显示，以C10/C11单克隆抗体--阳性对照抗体，与待筛选单克隆抗体作用的巨细胞病毒感染的人胚成纤维细胞株细胞的胞核均出现明显的pp65蛋白荧光反应，与小鼠IgG作用不发生反应；由此获得了特异性识别抗巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体，为人巨细胞病毒病毒pp65蛋白抗原血症检测试剂的研制奠定了基础；所需材料动物：6～8周的Balb/C小鼠，雌性，北京大学医学部实验动物科学部提供--SCXK(京)2004-002；试剂：100×HAT及100×HT添加剂、82氮杂鸟嘌呤、福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂、RPM 1640培养基均为Gibco BRL产品；相对分子质量为1500的聚乙二醇为Sigma产品；胎牛血清为Hyclone产品；FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma产品；巨细胞病毒-AD169病毒株与人胚成纤维细胞株HELF；pp65蛋白C10/C11单克隆抗体，IgG亚类检测试剂盒1A6，4A8抗PP65蛋白单克隆抗体的基本特性以PP65蛋白为抗原，间接ELISA检测腹水的抗体滴度分别为1∶104与1∶105；这些单克隆抗体均为IgG2a亚类免疫球蛋白；1A6，4A8间接免疫荧光技术检测巨细胞病毒感染人胚成纤维细胞株HELF细胞中pp65蛋白的表达；结果显示，C10/C11单克隆抗体--阳性对照与待筛选单克隆抗体作用的巨细胞病毒感染的人胚成纤维细胞株HELF细胞的胞核均出现明显的pp65蛋白荧光反应，小鼠IgG作用不与病毒感染细胞发生反应；(2)直接裂解红细胞技术：基本过程：采用的快速抗原血症检测采用直接在2ml全血中裂解红细胞的程序，然后是对细胞密度进行调整/离心分离，大大缩短了处理时间；操作程序：使用前完全混合均匀，按1∶19-20倍的比例加入到去离子水中；轻轻地倒置容器混合样本；不要使用混匀器；将2ml全血+6ml配制后的红细胞裂解液加入一个15ml锥形离心管中用移液器轻轻混合均匀在室温放置5分钟；在+2~+8℃、160g下离心10分钟；轻轻翻转试管，将上清液倒入消毒液中--0.5％或1％的次氯酸钠；保留沉淀物，小心操作，不要将细胞沉淀去除；加入3ml配制后的红细胞裂解液使血细胞重新悬浮；不要在室温放置，立即执行下一步操作；在+2~+8℃、160g下离心10分钟；按照前面的方法再一次将试管翻转去除上清液，注意不要将细胞沉淀去除；加入1ml配制后的试剂A--PBS使血细胞重新悬浮，用移液器将其轻轻混合均匀；调整细胞密度技术指标：镜下检测显微镜下细胞易于辨别，细胞形态好，红细胞碎片少；试剂盒中试剂组份SUPER002-A PBS 5瓶 干粉 稀释至5LSUPER002-B 红细胞裂解液 1瓶 45ml(20x浓缩) 稀释至900mlSUPER002-C 固定液 1瓶 110ml(5x浓缩) 稀释至550mlSUPER002-D 胎牛血清 1瓶 30ml 用于洗液SUPER002-E 通透液 1瓶 110ml(5x浓缩) 稀释至550mlSUPER002-F 抗HCMVpp65单克隆混合抗体 1瓶 3ml 备用SUPER002-H FITC标记的二抗(抗鼠IgG+IgM)F(ab)2 1瓶 3ml 备用SUPER002-J 封片剂 1瓶 4ml 备用SUPER002-K 白细胞分离液(右旋糖苷) 1瓶 60ml 备用SUPER002-M 显微镜载玻片 100张 备用各组份配方：A PBS：磷酸盐缓冲液-PBS，pH 7.3 0.15mol/L NaCl，0.01mol/L NaH2PO4，NaOH调pH至7.3B 红细胞裂解液：C 固定液：中性多聚甲醛溶液多聚甲醛，双蒸水配成4％溶液，NaOH调pH至7.3D 胎牛血清：外购E 通透液：F 抗HCMVpp65单克隆混合抗体：H FITC标记的二抗--抗鼠IgG+IgM-F(ab)2：购自SIGMA公司J 封片剂：K 白细胞分离液--右旋糖苷：称取5g葡聚糖于烧杯中，加入100ml PBS，0.02g叠氮钠，混匀。M 显微镜载玻片：多具赖氨酸处理。