[发明专利]根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法

摘要

根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。本发明通过构建质粒pCAM3300－zeocin，将其电击转化根癌农杆菌。通过将含有目的质粒pCAM3300－zeocin的根癌农杆菌和产甘油假丝酵母共培养，利用zeocin抗性基因为筛选标记，实现了pCAM3300－zeocin对产甘油假丝酵母的转化。根据根癌农杆菌的生长特性，对转化条件进行了优化，在共培养时间为24h，细胞比例为1∶500－1000时最高转化率达到2个转化子/10⁴个酵母细胞。初步建立了根癌农杆菌介导转化工业化产甘油假丝酵母的转化方法，为进一步研究产甘油假丝酵母打下基础。

主权项

1.根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，其特征是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得zeocin抗性基因，再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300-zeocin；质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母；(1)zeocin基因的克隆根据zeocin基因的特异性设计引物：引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；PCR扩增zeocin基因得到300 bp的特异条带；PCR方法如下：取质粒pPICZB模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL；循环参数：94℃预变性5min，94℃45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35个循环，72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easyvector连接保存；再用相应EcoR I酶切，胶回收zeocin目标基因，EcoR I酶切线性化质粒pCAM 3300；在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeocin；(2)质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404将重组质粒pCAM 3300-zeocin通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ；(3)根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母：将重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培养基中，30℃，200 r/min摇床培养36 h，离心收集菌体；用等体积的IM培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母WL2002-5于YPD培养基中，30℃、200r/min摇床培养过夜；产甘油假丝酵母的YPD培养液按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h；分别离心收集根癌农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL，各取50μL加入20mL IM培养基中30℃200r/min共培养过夜；取200μL培养液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25℃培养24h；将玻璃纸转接到SM培养基上培养两天，筛选阳性酵母转化子。