[发明专利]人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法和应用

摘要

人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法和应用，涉及一种人PEX外泌型重组腺病毒构建方法。提供一种带Myc标签的人PEX外泌型重组腺病毒构建方法，步骤为质粒pSecTag A/PEX的构建：pGEX－4T－3/PEX215质粒的构建；PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA；真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建。腺病毒穿梭载体pShuttle－CMV－PEX的构建。大肠杆菌中腺病毒的同源重组。阳性pAdEasy－pShuttle－CMV－PEX(Ad－PEX)重组子的扩增。重组腺病毒Ad－PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒。可用于治疗肿瘤等血管生成相关疾病的基因治疗药物。

主权项

1.人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法，其特征在于所说的构建方法如下：步骤1、质粒pSecTag A/PEX的构建1)pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建(1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链；(2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3的多克隆位点，设计二个PCR引物，上游引物PEX446S，序列为5’-CTG AAT TCC TCT CCT GACATT GAC CTT G-3’，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；下游引物PEX660A，序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215；(4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215；2)PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，带限制性内切酶Sfi I酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用引物PEX466sense与PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的PEX蛋白；3)真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建将PCR扩增的PEX cDNA片段和载体pSecTag A经Sfi I和XhoI双酶切后，经连接酶连接后构建质粒pSecTag A/PEX，该质粒表达的PEX蛋白N端带有Ig κ-链前导链，C端带有Myc表位标签，lg κ-链前导肽可介导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性PEX蛋白的检测以区别于内源性PEX蛋白；步骤2：腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-PEX的构建根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其阅读框架、pShuttle-CMV载体多克隆位点以及编码框架，设计二条PCR反应引物，其中上游引物PEX466leader序列为5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’，带完整Kozak翻译起始序列和限制性内切酶NotI酶切位点，下游引物PEX660Myc序列为5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’，末端带限制性内切酶Hind III酶切位点和终止密码子TGA；以步骤1构建的质粒pSecTag A/PEX为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc扩增人MMP2 cDNA1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的195aaPEX片段，并在表达的PEX N-端带有Ig κ-链前导链METDTLLLWVLLLWVPGSTGD，C-端带有Myc表位EQKLISEEDLN检测标签，将PCR扩增得到的插入片段重组入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建pShuttle-CMV-PEX质粒；步骤3：大肠杆菌中腺病毒的同源重组将质粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切线性化和磷酸化酶处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，二者同源重组生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX；步骤4：阳性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重组子的扩增将确定阳性重组子的病毒载体pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX电转化入大肠杆菌DH10B扩增，扩增后提取质粒，该病毒能在细胞中表达N-端带Ig κ-链前导肽、C-端带Myc表位标签的PEX蛋白，Ig κ-链前导肽可诱导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性目的蛋白的检测以区别于肿瘤内源性PEX；步骤5：重组腺病毒Ad-PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒将重组腺病毒酶切线性化后转染入HEK293细胞包装成完整的腺病毒。