[发明专利]从胎盘组织克隆人基质金属蛋白酶2C端片段PEXcDNA的方法

摘要

从胎盘组织克隆人基质金属蛋白酶2C端片段PEX cDNA的方法。以从人胎盘组织提取的总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链，根据人MMP2序列和载体pGEX－4T－3、pGEX－5X－1的多克隆位点，设计PCR引物PEX446S、PEX462S和PEX660A，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A、上游引物PEX462S和下游引物PEX660A扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp cDNA片段PEX215和人MMP2 cDNA 1676bp～2304bp片段PEX198，重组于GST融合蛋白表达载体pGEX－4T－3和pGEX－5X－1，获重组质粒。

主权项

1.从胎盘组织克隆人基质金属蛋白酶2 C端片段PEX cDNA的方法，其特征在于所说的方法步骤如下：步骤1 提取胎盘组织总RNA：从新鲜胎盘中提取胎盘组织总RNA；步骤2用RT-PCR方法扩增不同长度人MMP2 C端PEX cDNA片段：(1)以胎盘组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链，(2)根据Genbank Accession No.：NM_004530的人MMP2序列和载体pGEX-4T-3、pGEX-5X-1多克隆位点，设计三条PCR引物，分别为PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX462S：序列为5’-GA GAA TTC CCT GTC ACT CCT GAG-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点；(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段PEX215，该cDNA片段编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段；(4)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX462S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1676bp～2304bp片段，即长度为629bp的PEX cDNA片段PEX198，该cDNA片段编码人MMP2从462aa到660aa的PEX片段；步骤3原核表达载体pGEX-4T-3/PEX215和pGEX-5X-1/PEX198的构建：将PEX215和PEX198两种不同长度人MMP2 C端PEX片段cDNA分别重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3和pGEX-5X-1，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215和pGEX-5X-1/PEX198。