[发明专利]人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法及其应用

摘要

人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法及其应用，涉及一种真核表达质粒。根据人MMP2序列及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，以pGEX－4T－3/PEX215质粒为模板，以PCR技术扩增人MMP2C端片段PEXcDNA，再构建真核表达质粒pSecTag A/PEX。构建方法更加简捷，同时用人PEX cDNA作为插入片段构建的真核表达载体更有利于人PEX细胞功能研究和相关应用研究。所构建的质粒可作为一种基因治疗药物用于肿瘤等相关疾病的治疗。

主权项

1.人PEX分泌型真核表达质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1、pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建(1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链；(2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3(AmershamBiosciences公司产品)的多克隆位点，设计PCR引物PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点；(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215；(4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215；步骤2、PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，带限制性内切酶Sfi I酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用引物PEX466sense与PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的PEX蛋白；步骤3、真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建将PCR扩增的PEX cDNA片段和载体pSecTag A经Sfi I和XhoI双酶切后，经连接酶连接后构建质粒pSecTag A/PEX，该质粒表达的PEX蛋白N端带有Ig κ-链前导链，C端带有Myc表位标签，Ig κ-链前导肽可介导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性PEX蛋白的检测以区别于内源性PEX蛋白。