[发明专利]一种抑制core1 β1－3半乳糖基转移酶的shRNA表达载体的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种抑制corel β1－3半乳糖基转移酶载体的shRNA真核表达载体的构建方法及应用，其步骤是根据Genebank提供的Corel beta1，3－galactosyltransferase的基因序列，选取一段21nt的核苷酸序列作为靶序列，设计并合成引物，通过引物退火，连接至载体psilencer1.0－U6，得到真核表达载体pu6－shRNAe，将pu6－shRNAe经肌肉注射至Balb/C小鼠，能显著降低小鼠T细胞活性，抑制小鼠免疫功能，该质粒在制备治疗或预防移植排斥反应、抑制T细胞活性的药物中应用前景广泛。

主权项

1.一种抑制core1β1-3半乳糖基转移酶的shRNA载体的构建方法，其特征是它包括下列步骤：A.靶序列的选择及引物的合成：根据GeneBank提供的Core1 beta1，3-galactosyltransferase基因序列，选取一段21nt的核苷酸序列作为靶序列，并设计并合成引物，引物为：Oligo1.5’GCGAAGATTTAAGCCCTATGTTTCA 3’；Oligo2.5’AGCTTGAAACATAGGGCTTAAATCTTCGCGGCC 3’；Oligo3.5’AGCTTACATAGGGCTTAAATCTTCGCTTTT 3’；Oligo4.5’AATTAAAAGCGAAGATTTAAGCCCTATGTA 3’。B.pu6-shRNAe的构建及鉴定将Oligo1和Oligo2稀释至10pmol·ml-1，各取2μl混合，加水稀释至20μl，95℃5min，55℃10min，然后冷却至室温，Oligo1和Oligo2退火形成双链，再与经ApaI和HindIII双酶切回收后的质粒pSilencerl.0-U6连接，转化至感受态DH5α，挑取单个菌落，经Apa I和HindIII酶切鉴定，克隆标记为pU6-galtl2。pU6-galtl2经ApaI和HindIII双酶切，回收后与Oligo3和Oligo4的退火产物连接，转化至感受态DH5α，挑取单个菌落，经EcoR I和HindIII酶切鉴定，克隆经测序鉴定，得到重组质粒pu6-shRNAe；C.特异性pu6-shRNAe转染CT-26细胞提取pu6-shRNAe质粒，测定DNA浓度，将4μgDNA加入250μl无血清RPMI 1640培养基中，另取240μl无血清RPMI 1640培养基，其中加入10μl Lipofectamine 2000脂质体，5分钟内混合含DNA和脂质体的上述培养基，30分钟后将上述混合物加入CT-26细胞中；D.RT-PCR检测目的基因的表达：转染48h后收获上述转染的细胞，提取细胞的总RNA，进行RT-PCR，内参G3DPH上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′，core1β1-3半乳糖基转移酶基因上游引物：5′CAGTCACCTCAAAGGACAGA 3′，下游引物：5′GGAATCTCCAGC-TTCTACAT 3′，PCR反应体系为：10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP 1μl上游引物(20μM) 1μl下游引物(20μM) 1μl模板 1μlTaq DNA聚合酶 1μl灭菌双蒸水 37μl总体积 50μl反应条件：95℃，5min；95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28个循环；72℃，5min，将PCR产物进行凝胶电泳并测定灰度，将目的基因与内参G3PDH的比值进行比较判断目的基因表达。